常见问题与对策

从组织取材和固定、抗原修复、抗体选择到最后显色整个免疫组织化学染色过程中的每个环节都会影响染色质量。因此,染色过程中出现的任何异常,都要结合不同实验对照,从源头开始逐一查找原因。

(一)全片不着色

染色结束后切片中看不到任何阳性信号。这种现象出现可能有两种原因。一是真阴性,实验过程没有任何问题,组织和细胞确实不表达待测抗原;二是假阴性,因为实验过程中的失误导致染色的失败。

常见原因及对策:利用阳性对照判断。阳性对照片阳性,说明实验没有问题,是真阴性;阳性对照片阴性,说明染色过程中出现了问题,需要从实验的各个环节查找原因,常见原因有:第一抗体与组织抗原性不匹配;第一抗体要求只能用于新鲜组织冷冻切片或需要抗原修复,而实验用了石蜡包埋组织或未行抗原修复;检测试剂盒与第一抗体不匹配;抗体浓度太低或温育时间太短;固定和包埋温度过高造成抗原活性破坏;标本脱蜡不充分导致抗原的抗原性改变、破坏或隐匿。另外,抗体失活等试剂质量问题或操作的某些失误也会导致假阴性。

(二)染色过弱

组织细胞本应有较强阳性表达,但却表现为弱阳性,背景非特异性反应可有可无。

常见原因及对策:通过阳性对照多能判断出这种现象的可能原因,如果阳性对照反应良好,待测组织染色较弱,则应考虑组织处理出现的问题,如组织处理时温度过高致使抗原活性丢失、抗原修复或脱蜡不充分致使抗原暴露不全等;如果阳性对照和待测组织染色都比较弱,应考虑抗体和检测系统的问题,如一抗浓度低或温育时间短,抗体效价太低或实验操作不当导致的反应体系中某种试剂有效浓度降低等。此时,如背景反应不强,可考虑提高一抗浓度、延长一抗温育时间或加强石蜡切片的抗原修复或消化及延长显色时间;如背景反应较强,应降低一抗浓度,延长一抗温育时间,延长显色前洗涤时间。冬天环境温度较低,洗涤可用37℃温水。

(三)全片着色

整个切片的全部组织、细胞都染色,着色强度可深可浅,分不清哪些是阳性,哪些是阴性。

常见原因及对策:出现这种现象的常见原因是抗体浓度过高、抗体温育时间过长或温育温度过高、DAB变质或显色时间过长,还有操作过程中组织在空气中暴露时间过长导致的组织变干、多克隆抗体特异性较差、标本固定不佳造成的抗原扩散、抗体交叉反应等。可以通过阴性对照、空白对照判断问题的原因,有针对性地加以纠正。

(四)组织或细胞非特异性着色

表现为切片细胞抗原间质着色、核抗原胞质着色或胞质抗原细胞核着色等。

常见原因及对策:间质着色最常见原因是抗体与组织中蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成的非特异性连接,适当延长血清封阻时间可能会改善染色效果。抗体不纯或抗体被污染也会造成间质着色,应考虑更换抗体。非特异性胞质着色的原因常为胞质内含有较多蛋白质,内源性过氧化物酶或内源性生物素,可通过用3%过氧化氢、非免疫动物血清封阻来改善;热抗原修复暴露的内源性生物素可用蛋清封闭,也可改用非生物素检测系统。组织处理不当可以出现细胞核着色,如在二甲苯、缓冲液里浸泡时间过长等,解决办法是操作严格按规范进行。

(五)“区域性”非特异性染色

阳性染色出现在切片的某些区域,阳性区域背景着色通常比较深,如:切片边缘着色、“阴阳脸”着色、灶状着色。

常见原因及对策:切片边缘着色的现象称为边缘效应。常见原因有:组织边缘与玻片粘贴不牢,边缘组织松脱,每次清洗难以将组织下面的试剂洗净。因此,应尽量使用优质过胶片,组织片应尽可能薄,组织前处理应规范,也要尽可能避免选用坏死较多的组织。染色过程中,组织片边缘的试剂容易首先变干,导致此处试剂浓度高于组织片中心,而致染色较深。因此,实验过程中试剂要充分覆盖组织,最好超出组织边缘2mm。“阴阳脸”着色是指组织一半着色一半不着色,其原因是试剂仅覆盖了部分组织而未能全部覆盖。实验操作应仔细,将试剂覆盖全部组织,避免试剂产生气泡以及倾斜导致试剂覆盖不全。灶状着色是指切片中着色区呈灶状分布,常见原因为裱片时气泡造成组织不平整,局部突起,染色时试剂渗入,不易洗净,致局部显色过深。裱片时应将切片倾斜,以便水分流走、蒸发。过胶片制作过程中APES浓度过高,在载玻片上分布不均,形成小白点,显色时着色。另外,坏死组织灶也可导致非特异性着色。因此,过胶片应严格按照标准制备程序制备,应尽量选择坏死组织少的切片。