细菌学诊断

细菌学诊断以检测病原菌及其代谢产物、抗原或核酸为目的，通过不同的途径确定致病菌的种类。用于细菌学诊断的检验方法有形态学检查、病原菌的分离和鉴定、病原菌抗原检测、病原菌核酸检测等。

（一）标本采集

临床标本的质量直接影响到致病菌检出的成败，为了提高致病菌检出率，避免诊断错误或漏检，标本采集与送检过程应遵循以下原则。

1．收集标本的容器必须无菌，但不得用消毒剂处理。

2．采集标本应在疾病早期和使用抗菌药物之前，对已使用抗菌药物患者的标本应注明药物种类，以便实验室采取适当措施处理。

3．采集标本时严格执行无菌操作，尽量避免患者正常菌群或外界环境中的杂菌污染标本。

4．根据致病菌在患者不同病期的体内分布和排出部位，采集不同的标本。如流行性脑膜炎病人取脑脊液、血液或出血瘀斑；伤寒病人在病程1～2周取血液，2～3周时取粪便。尽可能采集病变明显部位的材料，如菌痢患者取其带有脓血或黏液的粪便，肺结核病人取其干酪样含血丝的痰液等。

5．标本采集后应尽快送检，绝大多数细菌标本可冷藏送检，但对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等要注意保温。做厌氧培养的标本必须与空气隔绝。

6．标本要做好标记，详细填写化验单，如标本类型、临床诊断、检验目的等，以保证各环节准确无误，并可供检验过程中参考。

（二）形态学检查

将临床标本直接涂片、染色、镜检，根据细菌形态、结构、大小、排列方式和染色性可对病原菌初步识别和分类。对某些形态和染色性上具有特征性的致病菌，有助于初步诊断或确诊。如脑脊液内检出成双排列的革兰阴性球菌（脑膜炎奈瑟菌）、痰标本中发现细长略带弯曲的抗酸染色阳性菌（结核分枝杆菌）等。如果是为了观察细菌运动情况，标本不需染色而用压滴法或悬滴法直接观察即可，如疑似霍乱的粪便标本，可直接在显微镜下观察其流星样运动。但多数细菌的形态和染色性没有可与其他细菌相区别的明显特征，需经分离培养后进行鉴定。

（三）病原菌的分离和鉴定

原则上所有标本均应做分离培养，获得纯培养物后进一步鉴定。这是确诊细菌感染性疾病最可靠的方法（金标准），并可根据药敏结果指导临床抗菌治疗。

1．分离培养　由于不同细菌培养所需的条件不同，因此，必须根据临床要求、送检标本的性质和培养目的，选用适宜的培养基（普通琼脂平板、血琼脂平板、选择培养基等），采用不同的分离接种方法以及培养条件（温度、气体环境等）进行培养。大多数细菌经18～24h即可形成肉眼可见的菌落。根据细菌所需营养、生长条件、尤其是菌落特征（色素、溶血、菌落形状等）可作初步鉴别，但确诊还需对纯培养物进行形态特征、生化试验、血清学试验等项鉴定。

2．鉴定方法

（1）形态学检查：细菌菌落可随营养条件、生长环境、培养时间等因素而变化，而且不同的细菌可形成相似的菌落，因此，对分离菌进行染色检查就成为致病菌分离鉴定的常规项目。最常用的染色方法是革兰染色，根据染色结果以及菌的形态特点，可将病原菌初步分类。

（2）生化试验：细菌的代谢活动依靠一系列酶的催化作用，不同致病菌具有不同的酶系，对营养物质的分解能力及其代谢产物不尽相同，借此可对细菌进行鉴别，称之为细菌的生化试验。生化试验对菌体形态、染色性和菌落特征相同或相似的细菌（如肠道杆菌）的鉴别尤为重要。现已有多种微量、快速、半自动或全自动的细菌生化反应试剂条（板）和检测仪器在临床上广泛应用。

（3）血清学鉴定：用含有已知特异抗体的血清与分离培养出的未知纯种细菌进行血清学试验，可以确定致病菌的种或型。常用方法是玻片凝集试验，在数分钟内就能得出结果。如福氏志贺菌种、型的确定，须应用福氏志贺菌的种、型特异血清进行凝集试验。

（4）动物实验：动物实验主要用于检测细菌的毒力，以判定分离菌的致病性。常用实验动物有小鼠、豚鼠和家兔等。应根据实验目的，选用合乎标准的动物，采取合适的接种途径。接种后根据动物的临床症状以及解剖后病变特点，确定致病菌种类。如用家兔或豚鼠皮肤检测白喉棒状杆菌是否产生白喉毒素、家兔结扎肠段测定大肠埃希菌不耐热肠毒素等。动物实验一般不作为细菌学鉴定的常规项目。

（5）药物敏感试验：药物敏感试验结果对临床选择治疗用药有重要的指导意义，也是临床医生送检标本进行病原菌分离鉴定的主要目的之一。方法有纸片扩散法、稀释法、E试验等。纸片扩散法是根据抑菌圈有无、大小来判定测试菌对该抗菌药物耐药或敏感。试管法是以能抑制细菌生长的抗菌药物的最高稀释度作为测试菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）MIC的值越低，表示细菌对该药越敏感。

（四）病原菌抗原检测

从患者标本中分离并鉴定出病原菌，虽然是诊断细菌感染的最可靠依据，但往往由于各种原因而不能分离出病原菌。如患者使用了抗生素，标本中的病原菌被抑制等。但我们采用免疫学技术，用特异性抗体检测标本中病原菌的抗原成分可达到目的。即使标本中的病原菌已死亡，也不影响检出率。而且极微量的抗原成分即可检测到，敏感性高。常用于细菌学诊断的免疫学技术有以下几种方法。

1．协同凝集试验　常用于可溶性抗原的检测。如流行性脑脊髓膜炎、霍乱、痢疾的快速诊断。

2．免疫荧光技术　如志贺菌、霍乱弧菌的荧光菌球检查法。

3．酶免疫技术　目前常用的方法有酶联免疫吸附法和酶标免疫组化法。主要用于淋病奈瑟菌、沙门菌等检测。

4．对流免疫电泳　常用于检测脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌或流感嗜血杆菌的多糖抗原。

除以上方法外，胶体金技术、免疫印迹技术、发光免疫技术等亦可用于临床标本中病原菌抗原的鉴定。

（五）病原菌核酸的检测

不同种的细菌具有不同的基因结构，通过测定标本中致病菌的特异性核酸片段，即可确定致病菌。尤其适用于检测难以培养或不能培养的致病菌，以及培养时间较长或培养条件苛刻的致病菌（如立克次体、衣原体、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、嗜肺军团菌和无芽胞厌氧菌等）。常用检测方法有：核酸杂交技术、PCR技术（包括反转录PCR、定量实时荧光PCR）、基因芯片技术等。其中PCR技术，因其特异性强、敏感度高、快速等特点，而广泛用于感染性疾病的细菌学诊断。