细菌形态学检查

（一）显微镜检查

1．普通光学显微镜 细菌形态学检查中常用。通常以自然光或灯光为光源，其波长约0．5μm。在普通光学显微镜下用油镜放大1 000倍可以观察到细菌的一般形态和结构。

2．暗视野显微镜 用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器。在强光的照射下，可以在黑暗的背景中看到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效果，多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。

3．相差显微镜 利用相差板的光栅作用，改变直射光的光相和振幅，将光相的差异转换成光强度的差异，使细菌中部分结构比其他部分深暗。主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。

4．荧光显微镜 以紫外光或蓝紫光为光源，激发荧光物质发光使之成为可见光。细菌经荧光色素染色后，在荧光显微镜下可激发荧光，在暗色的背景下可以看到发射荧光的细菌。

5．电子显微镜 以电子流代替光源，分辨能力大大提高，放大倍数可达数万至数十万倍，能分辨1nm的物体，细菌的表面形态和内部超微结构均能清楚地显现。但标本需经特殊制片，在干燥真空的状态下检查，不能观察到活的微生物。有透射电子显微镜和扫描电子显微镜两种。前者适于观察细菌内部的超微结构，后者适于对细菌表面结构及附件的观察。

（二）细菌标本的检查

1．不染色标本的检查 主要检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用的有压滴法和悬滴法，以普通光学显微镜观察。如有动力，可看到细菌有明显的方向性位移。如用暗视野显微镜或相差显微镜观察，则效果更好。此外螺旋体不易着色并有形态特征，多用不染色标本做暗视野显微镜检查。

2．染色标本的检查

（1）常用染料：多为人工合成的含苯环的有机化合物，在苯环上带有色基与助色基。根据助色基解离后的带电情况，可将染料分为碱性、酸性与复合染料。①碱性染料：电离后显色离子带正电荷，细菌一般情况下都带负电荷，因此能与细菌结合，细菌学检查中常用此类染料。常用有碱性复红、结晶紫、亚甲蓝等；②酸性染料：电离后显色离子带负电荷，一般细菌不易着色，常用来染细胞质，常用的有伊红、刚果红等；③复合染料（中性染料）：复合染料是碱性和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等。

（2）常用染色方法：细菌染色的基本程序：涂片（干燥）→固定→染色（初染－媒染－脱色－复染）。

①单染色法：用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色。可观察其形态、排列、大小及简单结构，不能显示各种细菌染色性的差异。

②复染色法：用两种或两种以上的染料染色的方法。a．革兰染色：细菌学中最经典、最常用的染色方法。除粪便、血液等极少数标本外，绝大多数标本在分离培养之前都要进行革兰染色镜检。细菌经涂片干燥固定后先用结晶紫初染，水洗后加碘液染色，水洗，95%乙醇脱色，水洗，稀释石炭酸复红染色，水洗，吸干后油镜镜检，结果革兰阳性菌为紫色，革兰阴性菌呈红色。有时结合细菌特殊形态结构及排列方式，对病原菌可进行初步鉴定，还可为临床选择用药提供参考。b．抗酸染色：不作为临床上常规的细菌检查项目，只用于结核病、麻风病等的细菌检查。疑似结核分枝杆菌感染的标本，经抗酸染色后以油镜检查，即可作出初步鉴定。

③荧光染色：敏感性强，效率高而且容易观察结果。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。痰标本涂片、固定，用荧光染料金胺O法（金胺O－罗丹明B法）染色，以荧光显微镜检查，可观察到呈金黄色荧光的菌球。

④特殊染色：a．异染颗粒染色，观察棒状杆菌属细菌菌体内的异染颗粒。奈瑟染色菌体淡黄褐色，异染颗粒深蓝色。阿尔培特染色菌体呈蓝绿色，异染颗粒蓝黑色。疑为白喉棒状杆菌感染，除证实为革兰阳性典型棒状杆菌外，还须用异染颗粒染色法，镜检异染颗粒，方可初步报告“检出形似白喉棒状杆菌”。b．荚膜染色，在涂片上加3%沙黄水染液加温染色3min。菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。c．芽胞染色，将涂片用孔雀绿水溶液加温染色，再用0．5%沙黄水溶液复染。菌体呈红色，芽胞呈绿色。d．鞭毛染色，鞭毛染色后于显微镜可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的数量及位置，在非发酵菌的鉴定中很重要。