分子生物学技术概论

随着分子生物学技术的飞速发展，对病原学鉴定和疾病的诊断已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，聚合酶链反应、分子杂交技术、分子生物传感器技术、分子生物芯片技术、分子生物纳米技术和分子蛋白组学在医学中逐步应用，使针对患者的临床诊疗更为合理和快速，对医学的发展起到重要作用，这些技术广泛地用于病毒、支原体、衣原体、肿瘤基因、遗传疾病等多种疾病的诊断。而在微生物领域中，对于一些难以捕捉的病原微生物及新的病原微生物的确认、对微生物亚群的分析，分子生物学技术打破了以往的禁区，为临床的监测和治疗提供有应用价值的信息。

一、聚合酶链反应（PCR）

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由：①高温变性（denature）模板；②引物与模板退火（Anneal）；③引物沿模板延伸（extension），三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增1倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因，扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：生成双链DNA中的特异序列作为探针；由少量mRNA生成cDNA文库；从cDNA中克隆某些基因；生成大量DNA以进行序列测定；突变的分析；染色体步移；RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

二、反转录PCR（RT－PCR）

RNA的多聚酶链式反应（RT－PCR）是以RNA为模板，联合反转录反应（reverse transcrip－tion，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个复制的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便，并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。RNA扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和反转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。

三、分子杂交技术

分子杂交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA）在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理形成异质双链的过程。杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交，即细胞原位杂交，探针必须经标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素，但由于同位素的不安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛的应用，而且在临床诊断上的应用也日趋增多。

四、核酸分子杂交的类型

核酸分子杂交可按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种类型。

液相杂交：液相杂交指所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相杂交是一种研究最早且操作复杂的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。其主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。

固相杂交：固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在溶液中。由于固相杂交具有未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，故该法最为常用。根据支持物的不同固相杂交又可为：滤膜杂交、菌落原位杂交和组织原位杂交。有3种固相支持体可用于杂交：硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman541滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。印迹杂交有DNA印迹杂交、斑点杂交（Dot blot）、菌落原位杂交、组织原位杂交等。