肿瘤的时辰放疗

肿瘤放射治疗（简称放疗）是利用射线杀死肿瘤细胞从而达到治愈肿瘤目的的方法。放射治疗已经历了1个多世纪的发展历史，是目前公认的对恶性肿瘤最有效的治疗手段之一。据统计，大约70%的肿瘤患者在治疗过程中需要放疗的介入，约有40%的肿瘤可以通过放疗根治。毫无疑问，放疗在恶性肿瘤的治疗中具有显著疗效。但同时，放射不良反应和损伤亦同时并存，高剂量射线在杀灭癌细胞的同时，也会损伤正常细胞，患者可能出现皮肤、胃肠系统甚至中枢神经系统的不良反应。当照射剂量增大到一定程度，超过正常组织细胞的承受能力时，在肿瘤细胞被杀灭的同时，正常组织细胞也受到明显的损伤。根据时辰生物学原理，肿瘤细胞与正常组织细胞在分裂增殖的时间节律性方面存在差异，因此，选择肿瘤细胞分裂增殖活跃、同时正常组织细胞的分裂增殖处于相对静止的时间进行放疗，力争最大限度地杀伤肿瘤细胞，将正常组织细胞的损伤程度降到最小，可提高放疗效果。

1．放射时辰生物学的基础研究　研究发现，对同步化体外培养的细胞进行放射时，G2期及M期细胞对射线敏感性最高，其次是G1期，S期末细胞对射线敏感性最低；静止期细胞较不断分裂的细胞对射线敏感性低。如增长迅速的肿瘤细胞较周围正常组织对射线的敏感性高，机体中代谢旺盛、处于不断更新的组织（如胃肠上皮细胞及骨髓细胞）对射线同样具有较高的敏感性，故正常组织细胞对射线的耐受性成为肿瘤放射治疗中放射剂量的限制因素。

哺乳动物组织细胞分裂呈现近日节律特征，不同组织细胞分裂的时间节律不同。肿瘤细胞生长、增殖的节律特征与正常组织细胞不同，因此正常组织与肿瘤组织在对射线敏感性的时间节律上具有差异。研究两者对射线敏感性的时间节律，选择肿瘤细胞对射线最敏感的时间或避开正常组织细胞对射线最敏感的时间进行放疗，可以明显改善肿瘤放疗的疗效，提高射线治疗的指数。

对哺乳动物组织细胞进行低剂量（0.5～1.0Gy）射线照射时，细胞分裂进程停止的时间与放射剂量呈正相关。对明-暗周期实施同步化的小鼠，由单一放射剂量诱导的有丝分裂期滞留的时间因对动物进行照射时间的不同而呈现明显差异，当细胞周期进程恢复后，损伤的细胞能继续分裂至若干代。然而大多数细胞于射线照射后第一次分裂结束即死亡，少数存活的细胞其细胞形态与正常细胞无明显区别，但细胞克隆形成率明显降低。

在食物与水可自由摄取的实验条件下，光照制采用常相光照（12 hour-light：12 hour-dark cycle，LD），对不同品系小鼠或大鼠进行全身单一剂量放射，不同时间放射导致的动物死亡率呈现近日节律。动物在黑暗期（活动相）、黑暗末期或光照早期动物死亡率较高；实行分割放疗（如给予X线分割放射7d，放射剂量2.26Gy/d）后发现，在光照中期给予放射的小鼠实验结束后90%存活，而在光照早期仅有30%小鼠存活，在黑暗中期也只有35%的存活率。可见相同剂量、不同时间照射后，动物对照射的反应是不同的。

Haus等将光照制均为LD12h﹕12h的BALB/c雄性小鼠分为2组，一组光照时间从06:00到18:00；另一组光照期为18:00到06:00。两组动物均在各自的光照条件下适应2周后，按3种不同剂量（4.0Gy、4.5Gy和5.0Gy）在24h内每间隔4小时（7个时间点）给予全身X线照射。结果显示，第一组LD50表现出近日节律，即在光照前半期的动物进行放射的LD50最低（即放射敏感性最高），光照末期放射的LD50最高（即放射抗拒性最大）；动物处在黑暗期时放射的LD50值均较高。在光照时间倒置了180°的第二组小鼠，不同时间放射后动物的死亡率及LD50曲线峰值与低谷值仍具有近日节律性，虽然相位较第一组稍有差异，但整体水平上仍表现出在暗期对射线敏感性高，而在光照末期对射线的敏感性最低，即具有最大的放射抗拒性。在不同时间对Fischer大鼠进行X线照射与体重下降两者间关系的研究中发现，在光照末期对大鼠进行照射其体重下降最不明显。

动物对射线毒性的敏感期在黑暗期（动物活动相）及休息早期（光照初期）；在光照晚期（休息的中晚期）动物对放射损伤有较强的抗拒性，对射线不敏感。放射毒性反应的近日节律性与射线损伤骨髓干细胞及胃肠道上皮细胞表现的节律性有关。

（1）择时放射与骨髓细胞的生物效应：骨髓在不同时间对射线具有不同的敏感性。在黑暗中期（活动相）对射线损伤最敏感，而在光照中期（休息相）对射线损伤耐受性较高；射线引起骨髓细胞生物效应的时间节律性与光照黑暗的时辰有关，而与光照的起始时间无明显相关。在光照制为LD12h﹕12h（L 06:00—18:00）的实验条件下，于6HALO（光照中期）及18HALO（黑暗中期）分别对两组DUB-ICR小鼠进行射线照射，并在照射后24h和60h两个时间点观察两组小鼠骨髓干细胞数量的改变，发现18HALO组骨髓干细胞数大量减少，而6HALO组照射后保持分化活性的干细胞数相对较多，足以再生分化恢复造血系统功能。将光照位相颠倒180°后，以不同时间放射治疗引起的骨髓干细胞数减少的节律变化为指标，对其与位相颠倒前的对应关系进行研究，实验中两组BALB/c雄性小鼠光照制均为LD12h﹕12h，一组光照时间控制在06:00—18:00，另一组光照时间控制在18:00—06:00。结果发现不同时间内射线照射，均可使有核细胞数量减少，但不同时间的放射使细胞数量减少的程度有所差异，表现出近日节律性。在黑暗中期放射，细胞数减少最明显，而在光照末期细胞存活相对最多。光照时间相位颠倒180°的小鼠同样表现出相似的近日节律。

在大多放射免疫治疗（radioimmunotherapy，RAIT）中，由放射性核素引起的骨髓放射性损伤同样是RAIT治疗中要考虑的重要因素。当选用小鼠（LD12h﹕12h，L 07:00—19:00）为实验动物，在2HALO（09:00）、6HALO（13:00）及9HALO（16:00）三个不同时间点注射带有放射性的抗体131I-NP-4anti-CEAIgG，剂量为940贝可（Bq）（最大耐受剂量），发现放射性抗体使小鼠嗜中性粒细胞减少（嗜中性粒细胞减少的程度与放射性物质引起的骨髓毒性呈正相关）。注射7d后，2HALO组下降达50%，9HALO组下降仅为32%；注射14d后，2HALO组87%粒细胞受到抑制，9HALO组的这一比率仅为64%。可见，9HALO组与2HALO组相比，放射性抗体所致的骨髓放射性损伤较轻。同一实验方法应用于荷瘤（G-39）小鼠的研究时亦发现，动物对射线的耐受性也呈现出时间节律性。2HALO组最大耐受剂量为940Bq，而9HALO组最大耐受剂量达到1 253Bq，9HALO组较2HALO组具有明显抑瘤效应。故而选择合理的时间注射放射性核素标记抗体，有助于更有效地抑制肿瘤的生长并可提高机体的最大耐受剂量、降低不良反应的程度。

（2）择时放射与胃肠道细胞的生物学效应：胃肠道上皮细胞的放射敏感性很高，急性放射损伤可引起胃肠黏膜的剥落、诱使溃疡形成，甚至诱发胃肠屏障功能障碍而导致严重的败血症等并发症。在啮齿类动物胃肠道全程，从舌、食管、胃、十二指肠、回肠、结肠到直肠，黏膜上皮细胞DNA的合成均表现出近日节律性，其差异仅表现在振幅的相位有所不同。目前，对人类肠黏膜上皮细胞DNA合成的昼夜节律性报道不一，这与不同研究者采用的检测手段及样本量大小不同有关。

不仅胃肠黏膜上皮细胞的DNA合成具有近日节律，射线引起的肠黏膜上皮细胞凋亡现象同样具有近日节律。对于啮齿类动物（LD12h﹕12h，L 06:00—18:00），γ射线在很宽的剂量范围内（0.14～9.0Gy）均能诱导小肠隐窝上皮细胞发生凋亡。凋亡的发生具有昼夜节律性，凋亡率最高的时间位于06:00—09:00（0～3HALO），最低时间为18:00—21:00（12～15HALO）。对实验动物持续照射γ或β射线时，这种节律性依然存在。

既往人们一直认为，射线引起的胃肠道毒性反应是射线对胃肠黏膜上皮细胞的直接损伤所致，然而近年的研究发现，微血管内皮细胞是放射线的最主要靶部位。在8～15Gy射线照射后1h即可检测到肠黏膜固有层微血管内皮细胞凋亡的发生，在照射后4h达到高峰；而15Gy射线照射后15h方能检测到小肠绒毛柱状上皮细胞凋亡的发生。放射引起的胃肠黏膜微血管损伤早于黏膜细胞本身的损伤，大量实验研究进一步证实，射线引起的肠黏膜上皮细胞凋亡的主要原因是肠黏膜微血管的损伤。如酸性神经鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASMase）可诱导血管内皮细胞凋亡，ASMase基因缺陷小鼠表现为对射线不敏感；一些细胞因子如VEGF、酸性及碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）及白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等可保护血管内皮细胞免受射线损伤，如在放射前或放射后立即给予此类细胞因子可明显减轻射线对细胞的损伤，逆转胃肠道不良反应，降低患者的死亡率。微血管损伤可能发展为各种临床常见的症状，最终诱发胃肠综合征，微血管系统在射线损伤的病理机制中具有重要作用。

2．肿瘤择时放疗的临床研究　对射线引起的哺乳动物组织细胞损伤的生物学效应已有了大量时辰生物学方面的基础研究，但临床研究的开展有限，目前仅见个别报道。

20世纪60年代初期，曾有学者对75例乳腺癌患者进行了检测，其中25例患者表现出肿瘤细胞对32P的吸收具有近日节律，且与患者体温的近日节律一致。选择32P吸收处于上升相及高峰相的时间进行放疗具有明显临床疗效。20世纪70年代末80年代初，Deka等对口腔肿瘤进行了择时放疗研究，研究对象为分化良好的口腔鳞状细胞癌患者50例，每间隔2h测定口腔肿瘤黏膜表面及对侧健康口腔黏膜表面温度，持续监测72h或96h，结果显示肿瘤与健侧口腔黏膜表面温度变化的近日节律一致。同时，他们在24h内对其中4例患者的肿瘤组织反复取样，检测肿瘤细胞的有丝分裂指数，结果表明肿瘤细胞有丝分裂指数与肿瘤表面温度具有明显相关性，以肿瘤表面温度作为肿瘤细胞分裂增殖标志节律的假设成立。在肿瘤表面温度最高时给予放疗，对肿瘤的抑制效应更为明显、患者的口腔黏膜不良反应也最严重，最大抑瘤率与最大毒性反应同时存在，因此治疗指数不高。但由于肿瘤的生长受到明显抑制，患者2年内的生存率提高了1倍。

总体而言，对肿瘤择时放疗研究的进展依然缓慢，特别是肿瘤择时放疗的临床研究，目前为止尚局限于体表肿瘤。肿瘤放射治疗的疗效及对治疗时间的选择有待于进一步深入研究。