丙烯酰胺的测定

测定丙烯酰胺的同位素内标法(SN/T2096—2008)，适用于油炸和焙烤食品中丙烯酰胺的检测。

1.原理

用水提取试样中的丙烯酰胺，提取液经石墨化碳黑层析柱净化，净化液中的丙烯酰胺经溴水衍生化后，用同位素标记的内标法，气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测。

2.试剂和材料

除另有说明，所用试剂均为分析纯，水为去离子水或相当纯度的水。

正己烷重蒸馏; 乙酸乙酯重蒸馏; 丙烯酰胺标准品: 纯度≥99%; 13C标记的丙烯酰胺标准品: 1000mg/L。

丙烯酰胺标准溶液: 准确称取适量的丙烯酰胺标准品(精确至0.1mg)，用水溶解，配制成浓度为10mg/L的标准储备溶液。根据需要用水稀释成适用浓度的标准工作溶液。

13C标记的丙烯酰胺标准溶液: 移取13C标记的丙烯酰胺标准品1m L，用水配制成浓度为10mg/L的标准储备溶液。根据需要用水稀释成适用浓度的标准工作溶液。

无水硫酸钠: 650℃灼烧4h，置于干燥器内保存。

石墨化碳黑固相萃取柱: 内填石墨化碳黑500mg，使用前分别用5m L甲醇和5m L水活化。

溴水: 含溴浓度≥3%; 氢溴酸: 浓度≥40.0%; 玻璃棉; 硫代硫酸钠水溶液:0.2mol/L。

3.仪器和设备

气相色谱-质谱仪(GC-MS)，带EI源; 旋转蒸发器; 振荡器; 冷冻离心机; 氮吹仪; 固相提取装置; 天平(精确到0.0001g)。

4.测定步骤

1)提取

准确称取已粉碎的样品20g(精确至1mg)于250m L三角瓶中，加水100m L，加1m L浓度为500ng/m L13C同位素标记的丙烯酰胺内标，振荡30min，取上清液25m L于50m L离心管中，加入正己烷20m L，振荡10min，离心(3000r/min)5min，弃去正己烷层。

2)净化

将离心管在12000r/min下，于4℃高速冷冻离心30min，上清液用玻璃棉过滤，将滤液加入石墨化碳黑固相萃取柱中，收集流出液，再用20m L纯净水淋洗，合并流出液和淋洗液用于衍生化。

3)衍生化

在净化液中加入7.5g溴化钾，用氢溴酸调节净化液至p H1～3，再加8m L溴水，在4℃条件下衍生过夜。滴加硫代硫酸钠溶液至黄色消失以除去残余的溴。将溶液转移到分液漏斗中，加20m L乙酸乙酯，振荡10min，静置分层，再分别用10m L乙酸乙酯提取两次，合并乙酸乙酯提取液。乙酸乙酯过无水硫酸钠后，旋转浓缩并定容至1.0m L，供GC-MS测定。

4)测定

(1)仪器条件

色谱柱: HP-530m×0.25mm(内径) ×0.25μm(膜厚)，HP-5(或相当者); 色谱柱温度: 65℃(1min)→15℃/min→280℃(15min); 进样口温度: 280℃; 离子源温度: 230℃; 传输线温度: 280℃; 离子源: EI源; 测定方式: 选择离子监测方式; 选择监测离子(m/z): 106， 150，152，110，153，155; 载气: 氦气，纯度99.999%，流速1.0m L/min; 进样方式: 无分流进样; 进样量: 1.0μL; 电子能量: 70e V。

(2)色谱-质谱确证和测定

在上述仪器条件下经衍生化的丙烯酰胺保留时间约为8.26min。气相色谱-质谱选择离子总离子流图参见图12-3。符合下列条件，即可确定样品中含有丙烯酰胺: 在保留时间8.26min附近有峰出现，选定的质谱碎片离子在样品的选择离子质谱图中都能出现，样品峰的质谱图中各碎片离子的相对丰度为153 155=1，150 152=1，106 150=0.6，110 153=0.6，以上离子相对丰度的偏差比不超过20%。以150和153定量。GC-MS图参见图12-4和12-5。

图12－3 丙烯酰胺标准品衍生物气相色谱－质谱选择离子总离子流图(TIC)

图12－4 丙烯酰胺衍生物标准品气相色谱－全扫描质谱图

图12－5 丙烯酰胺和其同位素的标记的丙烯酰胺质谱图(SIM)

(3)空白试验

除不加试样外，按上述测定步骤进行。

5.结果计算和表示

①丙烯酰胺和其同位素内标的相对校正因子，按下式计算:

式中: R——丙烯酰胺和其同位素内标的相对校正因子;

An——丙烯酰胺标样的峰面积(峰高);

A1——同位素内标的峰面积(峰高);

cn——丙烯酰胺标样的浓度，单位为纳克每毫升(ng/m L);

c1——同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升(ng/m L)。

②试样中丙烯酰胺的残留含量，按式(12-7)计算(计算结果需将空白值扣除):

式中: X——试样中丙烯酰胺含量，单位为纳克每克(ng/g);

R——丙烯酰胺和其同位素内标的相对校正因子;

Asn——实际样品丙烯酰胺衍生物的峰面积(峰高);

Asl——实际测定时同位素内标的峰面积(峰高);

msl——实际测定时同位素内标的量，单位为纳克(ng);

m——样品的质量，单位为克(g)。

6.测定低限、回收率、精密度

本标准测定低限为5ng/g; 丙烯酰胺添加浓度在5ng/g～1000ng/g范围，回收率为85%～106%; 样品添加浓度5ng/g，相对标准偏差为6.0%; 添加浓度1000ng/g，相对标准偏差为5.9%。