－测定抗－

实验二　生物素－亲和素技术：BAS－ELISA测定抗－HBs

在免疫酶技术中，可利用生物素－亲和素系统（biotin－avidin system，BAS）标记抗体，即BAS－ELISA技术，是一种新型生物放大技术，它使用生物素－亲和素－过氧化物酶双抗体夹心复合物作为指示剂，可进一步提高检测的敏感度。生物素（biotin）是广泛分布于动植物体内的一种生长因子，又称辅酶R或维生素H。亲和素（avidin）是卵白及某些微生物中的一种蛋白质，由4个亚单位组成。二者有高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性。

在生物素－亲和素系统中，借助所形成的亲和素－生物素－酶复合物，追踪生物素标记的抗原或抗体，通过酶催化底物显色，可检出相应的抗体或抗原。由于抗原或抗体分子可偶联多个生物素，且1个亲和素分子可结合4个生物素分子，组成新的生物放大系统，进一步提高检测的灵敏度。目前，BAS技术已在整个生物学领域中得到广泛应用，成为当今生物医学研究工作中最具使用价值和发展前途的技术之一。

BAS－ELISA用于检测的基本方法有以下三种：BA法或标记亲和素生物素法（LAB）、BAB法或桥联亲和素－生物素法（BRAB）和ABC法。

实验目的

（1）掌握BAS－ELISA测定抗－HBs实验原理。

（2）熟悉其操作方法、应用及临床意义。

实验原理

BAS－ELISA检测抗－HBs实验是采用ELISA间接法结合生物素－亲和素系统试剂，检测血清或血浆中抗－HBs水平。将包被有乙肝病毒表面抗原（HbsAg）的聚苯乙烯微量反应板各孔与标本一起温育。如果标本中有抗体，即与固相抗原反应。洗去未结合物，加标有生物素的抗人IgG单克隆抗体（B－MAHG），以形成固相HbsAg—抗－HBs—BMAHG复合物。洗去未结合的B－MAHG，加亲和素－生物素化辣根过氧化物酶复合物（ABC），洗去未结合的ABC，再加含有过氧化氢和邻苯二胺（OPD）的底物，底物被水解后其颜色深浅与标本抗－HBs的含量相一致。

实验材料

（1）商品化BAS－ELISA检测抗－HBs试剂盒。

①HBsAg（溶入含50%甘油的PBS中）。

②B－MAHG（溶入含50%甘油的PBS中）。

③ABC（溶入含50%甘油的PBS中）。

④阴性对照血清（3瓶）。

⑤阳性对照血清（1瓶）。

⑥OPD结晶。

⑦浓缩的HBsAg稀释剂。

⑧洗涤液。

⑨底物缓冲液。

⑩新生小牛血清。

〇11聚苯乙烯微量反应板。

（2）待检标本、3%过氧化氢、2mol/L硫酸、水浴箱、微量移液器、吸头及酶标检测仪等。

实验方法

（1）包被　将1mL HBsAg稀释剂和9mL蒸馏水吸入干净试管中，将全部HBsAg溶液移入试管混匀后，加入聚苯乙烯微量反应板100μL/孔。将微孔板置于湿盒内，置于37℃水浴2h或于4℃处过夜，洗涤3次（洗涤方法同“ELISA双抗体夹心法测HBsAg”步骤“3”手工洗涤）。

（2）封闭　将全部浓缩洗涤液移入1个干净烧杯，加入490mL蒸馏水，混匀后于37℃水浴2h即为洗涤液。将5mL HBsAg稀释剂、5mL新生小牛血清和40mL蒸馏水移入1个干净烧杯混匀即为封闭液。各孔加100μL封闭液。37℃水浴2h，洗涤3次（方法同上）。

（3）加样　分别将100μL阴性（3孔）和阳性（1孔）对照样品加入反应孔内。吸取100μL待检标本加于各反应孔。将聚苯乙烯微量反应板置于37℃水浴1h，洗涤3次（方法同上）。

（4）加B－MAGH　将全部B－MAHG溶液移入一个干净试管，加10mL封闭液并彻底混匀，各孔加100μL，置于37℃水浴45min，洗涤3次（方法同上）。

（5）加ABC　将全部ABC溶液移入一干净试管，加10mL封闭液并彻底混匀，各孔加100μL，置于37℃水浴30min，洗涤3次（方法同上）。

（6）加底物　将5mg OPD溶于10mL底物缓冲液，加150μL 3%过氧化氢混匀，各孔加100μL，置于37℃温育10min。

（7）测定　各孔加100μL 2mol/L硫酸以终止酶反应。在全自动酶标仪上以空白孔调零（492nm波长），测定各孔的OD值。

实验结果

将未知标本的净吸光度与阈值作比较，以确定是否存在抗－HBs。阈值是由阴性对照孔吸光度均值（An）与其三倍标准差之和确定的，见表4－1。

表4－1　阴性对照样品的吸光度值

An＝0．071，SD＝0．019，阈值＝An＋3×0．019＝0．128。

凡标本的吸光度（As）大于或等于阈值时，被认为具有抗－HBs反应性。若As小于阈值，则认为无抗－HBs反应性。

注意事项

（1）试剂应低温保存。且OPD和ABC应避免暴露在强光之下。

（2）底物液应现用现配且应避光放置。

（3）每次实验须作阴性对照和阳性对照。

思考题

（1）请分析一下BAS－ELISA法与ELISA法，前者灵敏度提高的原因是什么？

（2）简述检测血清或血浆中抗－HBs水平的临床意义。