毛细管区带电泳测定复方芦丁片中芦丁和抗坏血酸含量

实验30　毛细管区带电泳测定复方芦丁片中芦丁和抗坏血酸含量

一、目的

了解毛细管区带电泳的测定原理，掌握毛细管区带电泳－电化学氧化测定芦丁和抗坏血酸的方法，熟悉毛细管区带电泳－安培检测系统的使用。

二、内容提要

高效毛细管电泳（HPCE）是离子和带电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度（单位电场下离子的平均电泳速度）或分配系数不同进行高效、快速分离的一种电泳新技术。HPCE分为毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等速电泳（CITP）、毛细管等电聚焦电泳（CIEF）、毛细管凝胶电泳（CGE）和毛细管电动色谱（MEKC）等多种模式。本实验涉及的是毛细管区带电泳。

毛细管区带电泳是HPCE中最基本的分离模式，应用广泛。它的原理是，毛细管与两个电泳槽相连，内充有相同组分和相同浓度的背景电解质溶液（运行缓冲液）。样品溶液从毛细管的一端（进样端）导入，当毛细管两端加上一定的直流电压后，荷电溶质便向与其极性相反的电极移动，即为电泳。其迁移速度与电场强度、介质特性、离子的有效电荷及其大小和形状有关。同时，由于在熔融二氧化硅毛细管内表面硅羟基（Si－OH）的pK_a＝2.5，在碱性和微酸性溶液中Si－OH电离成SiO^－，使表面带负电荷。负电荷表面在溶液中积聚相反的正离子，形成双电层（包括紧密层和扩散层），其正电荷随着远离表面而逐渐与体相溶液接近，使体相溶液带正电。在电场的作用下，体相溶液整体向一个方向泳动，这种现象称之为电渗流（EOF），可以用中性的化合物（本实验用甲醇）标记。其中，毛细管内表面的双电层带电性质可以通过用阳离子型表面活性剂等手段加以改变，从而改变EOF方向。实际上，在毛细管中电泳与电渗流并存，在不考虑它们之间的相互作用时测定的离子迁移速度，是电泳和电渗流两个速度的矢量和，定义为表观迁移速度。带电粒子在单位电场下的表观迁移速度称为表观淌度。由于样品组分间的表观淌度不同，它们的表观迁移速度不同，因而经过一定时间以后，各组分将按其表观淌度大小顺序，依次到达检测器被检出，得到按时间分布的电泳图。谱峰的迁移时间t_m可以作为组分定性的依据，谱峰的高度h或峰面积A可作为定量分析的依据。

值得一提的是，电渗是伴随电泳产生的一种电动现象，在CE分离中扮演重要角色，多数情况下，EOF比电泳速度快5～7倍。因此，可利用CE分离将正、负离子和中性分子一起朝一个方向（本实验为阴极方向）产生差速迁移，在一次操作中同时完成正、负离子的分离分析。通过EOF大小和方向的控制，还可以影响CE分离的效率、选择性和分离度，故EOF是优化分离条件的重要参数。

HPCE最基本的仪器包括高压直流电源（0～±30kV）、毛细管［有熔融石英、玻璃和聚四氟乙烯（PTFE）等各种材质］和检测器（目前主要有紫外－可见光度、激光诱导荧光、电化学和质谱检测器）。CE电化学检测有3个模式：安培法、电导法和电位法。其中安培检测法（AD）的灵敏度高（达10^－8～10^－9 mol·L^－1），检测体积小，仪器设备简单，是一种有前途的CE检测方法。其原理是，测量化合物在工作电极表面发生氧化或还原反应时，产生与被分析物质浓度成正比的电极电流。本实验采用安培检测法，仪器的基本结构见图6－25。

图6-25　高效毛细管电泳－安培检测示意图

芦丁（Rutin，RT）是维生素P属中的一种，现已发现含RT的植物至少在70种以上，在食物中多与抗坏血酸［Ascorbic Acid，即维生素C（Vc）］共存。RT能增强Vc的活性和促进Vc在体内的蓄积，维持及恢复毛细血管的正常弹性，增强其抵抗力，防止血细胞凝聚。Vc是一种防治坏血病的水溶性维生素，参与体内多种代谢过程，可以增加机体抵抗力。本实验采用CE－AD测定复方芦丁片两种有效成分RT和Vc的含量。RT和Vc的结构见图6－26，它们的毛细管电泳谱图见图6－27。RT的分子量为610.52，Vc分子量为176.12。

图6-26　芦丁（RT）和抗坏血酸（Vc）的分子结构

6－27　5×10^－5 mol·L^－1 RT（1）和2.5×10^－4 mol·L^－1 Vc（2）混合标准液的毛细管电泳谱图

三、仪器和试剂

1.仪器

毛细管电泳－安培检测系统 自组装，包括±30kV高压电源、安培检测器、记录仪、40cm长熔融石英毛细管（i.d.25μm，o.d.360μm）、三维定位调节器、直径为300μm碳圆盘电极（用M5金相砂纸磨成盘状，在软纸上抛成镜面，用无水乙醇浸洗）

容量瓶　250mL，50mL

移液管　10mL

烧杯，漏斗等

2.试剂

芦丁（生化试剂）

抗坏血酸

复方芦丁片（有效期内）

运行缓冲液：25mmol·L^－1硼砂－50mmol·L^－1 NaH₂PO₄（pH8.0）

甲醇

四、实验步骤

1.标准储备液的配制

1）RT标准储备液（10^－3 mol·L^－1）：用运行缓冲液25mmol·L^－1硼砂－50mmol·L^－1 NaH₂PO₄（pH8.0）与甲醇（体积比50∶50）混合溶液溶解配制，为一黄色澄清溶液。

2）Vc标准储备液（10^－2 mol·L^－1）：用二次蒸馏水配制。

其他不同浓度的RT及Vc溶液用运行缓冲液稀释得到。

2.电极的安装

本实验应用自组装的CE－AD装置，电化学检测池为三电极体系，碳圆盘电极为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，铂丝为辅助电极。通过三维定位调节器使工作电极与毛细管出口在一条直线上，并尽可能靠近毛细管末端。

3.测定条件的选择

采用电动进样，条件为在15kV下从毛细管阳极端进样8s，检测池为电泳负极电泳槽。25mmol·L^－1硼砂－50mmol·L^－1 NaH₂PO₄（pH8.0）为运行缓冲液，分离电压为15kV，检测电位为1.0V（vs.SCE）。

4.标准曲线的绘制

配制5×10^－4 mol·L^－1 RT和2.5×10^－3 mol·L^－1 Vc的混合标准溶液，分别移取1.00、2.50、5.00、7.50及10.00mL该溶液于5个50mL容量瓶中，用运行缓冲液稀释至刻度，在上述选定条件下进行测试。测得的一组混合标准溶液的电泳图谱。

5.样品的测定

将20片复方芦丁片用研钵研成细粉，精密称取相当一片片剂质量的粉末于25mL溶量瓶中，用运行缓冲溶液25mmol·L^－1硼砂－50mmol·L^－1 NaH₂PO₄（pH8.0）与甲醇（体积比50∶50）混合溶液20mL于50℃水浴中预热15min后，得黄色悬浊溶液，定容至25mL，经普通滤纸过滤，取滤液2.50mL于50mL容量瓶中，用运行缓冲溶液稀释至刻度，经0.22μm聚丙烯滤膜过滤后，按选定条件进行测试，测得的样品的电泳图谱。

五、数据处理

1）由测得的混合标准溶液的电泳图谱，得到不同浓度下RT和Vc的峰高。以峰高与对应的浓度作标准曲线或拟合线性回归方程，并计算相关系数。

2）由测得样品的电泳图谱得到RT和Vc的峰高，从对应标的标准曲线或拟合线性回归方程得到RT和Vc浓度，进一步计算得到每一片复方芦丁片中RT和Vc的含量。

六、思考题

1.毛细管区带电泳对样品组分进行分离分析的原理是什么？

2.利用美国化学文摘（CA）查找有关同时测定芦丁和抗坏血酸的其他方法，并与本法进行比较。

3.安培检测的依据是什么？有什么特点？

参考文献

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）.北京：化学工业出版社，1995，824～826

［2］陈刚，丁祥欢，叶建农.毛细管区带电泳电化学检测法测定药物及果汁中的芦丁和L－抗坏血酸.高等学校化学学报，2000，21（9）：1364～1368