，-二硝基水杨酸法测定酵母蔗糖酶活力

一、目的要求

1．掌握酶活力测定的基本原理和方法。

2．学习酶的比活力的计算。

二、实验原理

蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶 EC3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的 1，2-糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热可被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内还原糖的含量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在 520 nm 进行比色测定，求得样品中的含糖量。

蔗糖酶活力单位（U）表示蔗糖酶在室温（25℃）、p H4.5的条件下，每分钟水解产生1 μmol葡萄糖所需的酶量。蔗糖酶比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位 U/mg 表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。

三、仪器与试剂

1．材料

蔗糖酶样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（来源于第三部分实验二）。

2．试剂

（1）1 g/L葡萄糖标准溶液（葡萄糖相对分子量198.17）。

（2）0.2 mol/L乙酸缓冲液，p H4.5。

（3）5%蔗糖溶液。

（4）3，5-二硝基水杨酸试剂。

甲液：溶解6.9 g结晶酚于15.2 m L 10%Na OH溶液中，并用水稀释至69 m L，在此溶液中加6.9 g亚硫酸氢钠。

乙液：称取255 g酒石酸钾钠加到300 m L 10%Na OH溶液中，再加入800 m L 1%3，5-二硝基水杨酸溶液。

甲乙二溶液相混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中备用，在室温放置7～10 d以后使用。

3．仪器

恒温水浴箱、可见光分光光度计、1 cm玻璃比色皿；试管、试管架；移液管；微量移液枪（200 μL，1 000 μL）。

四、实验操作与步骤

1．蔗糖酶活力的测定

（1）标准曲线的制作。以还原糖质量浓度（mg）为横坐标，A520 nm值为纵坐标，制作标准曲线。

（2）蔗糖酶的酶活力测定。

2．实验结果

（1）实验数据记录和处理，见表2-6-1、表2-6-2与表2-6-3。

表2-6-1 标准曲线的制备

表2-6-2 数据记录表1

（2）根据酶活力计算公式计算蔗糖酶活力和比活力，并比较各步纯化样品的纯度。

表2-6-3 数据记录表2

五、实验说明

（1）酶促反应最适合的p H值为4.5，通常使用p H计进行调节。

（2）将配制好的3，5-二硝基水杨酸溶液储存于棕色瓶中。

（3）葡萄糖标样要烘干。

六、思考题

1．酶的活力与哪些因素有关?

2．描述总蛋白、总活力、比活力、蛋白浓度之间的相互关系。

3．一般酶制剂中酶活力的测定常常采用哪些方法？