蔗糖酶活力的测定和比活力的分析

实验七　蔗糖酶活力的测定和比活力的分析

【实验目的】

1．制备蔗糖酶酶促反应进程曲线。

2．掌握蔗糖酶活力测定的一般方法。

3．了解和掌握比活力的概念和分析方法。

【实验原理】

蔗糖酶特异性催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性，能催化蔗糖水解生成D-果糖和D-葡萄糖，也能水解棉子糖生成密二糖和果糖。

3，5-二硝基水杨酸测定还原糖的原理:3，5-二硝基水杨酸与还原糖在强碱性溶液中在沸水浴条件下生成棕红色氨基化合物，该化合物在520nm处有最大吸收，在一定范围内颜色深浅与还原糖浓度成正比。

要进行酶的活力测定，首先要确定酶的反应时间。酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度范围内进行选择。要求出代表酶促反应初速度的时间范围就必须制作酶促反应的进程曲线。所谓进程曲线是指酶促反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。它表明了酶促反应随反应时间变化的情况。本实验的进程曲线是在酶促反应的最适条件下采用每间隔一定的时间测定产物生成量的方法，以酶促反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成的(图4-1)。从酶反应进程曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶促反应的初速度。但是，随着反应时间的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所致。因此，要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶促反应时间成正比的这一段时间内进行测定。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。制作进程曲线，求出酶促反应初速度的时间范围是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。

图4-1酶促反应的速度曲线

蔗糖酶酶活力单位定义为，在一定条件下，反应5分钟，每产生1 mg葡萄糖所需要的酶量。实际应用时将1 ml蔗糖酶酶液所产生的葡萄糖的量定为1ml酶液的活力。

酶的比活力即每mg酶蛋白质所具有的酶活力。

【实验器材】

分光光度计、恒温水浴锅、试管等。

【药品试剂】

1．1 mg/ml葡萄糖标准溶液。

2．0．1mol/L醋酸缓冲液pH5．0。

3．3，5-二硝基水杨酸试剂。

甲液:将6．9 g结晶酚溶解于15．2 ml 10%NaOH溶液中，并用水稀释到69 ml，再加入6．9 g亚硫酸钠。

乙液:取255 g酒石酸钾钠加到300 ml10%NaOH溶液中，加入800 ml 1%3，5-二硝基水杨酸溶液。将甲液和乙液混合后储存在棕色瓶中室温放置7～10天后使用。

4．0．1 mol/L NaOH溶液。

【实验方法】

1．蔗糖酶酶促反应曲线的制备:准备12支试管，按0到11的顺序对试管进行编号，空白对照管为“0”号。各管分别加入0．6 ml 300 mmol/L蔗糖溶液和1．3 ml pH5．0醋酸缓冲液后，在25℃预热3分钟。在1～11管内各加入0．1 ml预热的酶液。酶液加入后立即精确计时并摇匀，按时间3、5、7、10、12、15、20、25、30、40和50分钟在25℃恒温下进行定时酶促反应(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加入时为终止时间)。当酶促反应进行到上述相应的时间时，加入二硝基水杨酸试剂0．5 ml终止反应，时间控制和反应条件详见表4-4和表4-5。

表4-4　　　　　　　酶促反应时间安排

表4-5　　　　　　　酶促反应操作安排

以反应时间为横坐标，A₅₂₀为纵坐标绘制进程曲线，并将其贴在实验报告上，根据进程曲线求出蔗糖酶反应初速度的时间范围(直线部分涵盖的时间)。

2．葡萄糖标准曲线的制备:准备6支试管，按照表4-6进行加样。加样后混匀，盖上试管帽，于沸水浴(100℃)中准确煮5分钟，取出用自来水冷却3分钟，于520 nm处以零号试管样品调零，测定其余5支试管中样品的吸收值A₅₂₀。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。

表4-6　　　　　　　葡萄糖标准曲线的制备

3．蔗糖酶活性的测定:按照表4-7完成实验。

表4-7　　　　　　　蔗糖酶活力的测定

取出后用自来水冷却3分钟，于520 nm处以对照管样品调零点，测量测定管的吸收值A₅₂₀。从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量，并乘以10(上述反应中只加入0．1 ml稀释后的酶液)和稀释倍数，即为每1ml酶溶液(级分Ⅰ和级分Ⅱ)的活力。

4．蛋白质含量的测定:用考马斯亮蓝方法测定级分Ⅰ和级分Ⅱ中蛋白质的含量，计算出每ml级分Ⅰ和级分Ⅱ中的蛋白质量。具体方法参照蛋白质含量测定实验。

5．计算各级分的比活力、纯化倍数和回收率:

为了测定和计算上面纯化表(表4-8)中的各项数据，对各个级分都必须取样，每次取样都会造成一定的损失，因此要对下一级分的体积进行校正，使得回收率的计算不受到影响。下表举例说明了校正体积的计算方法(表4-9)。

表4-8酶的纯化表

表4-9　　　　　　　校正体积的计算

【注意事项】

比活力:酶的总活力单位数除以总蛋白毫克数，即每毫克蛋白所含有的酶活力单位数。

回收率:每一步所测得的总活力数与第一步总活力数的比值，以百分比表示。假设第一步的回收率为100%。

纯化倍数:每一步所得的比活力与第一步比活力的比值，开始时纯化倍数假设为1。

【思考题】

1．比活力的概念和酶纯化过程中测定比活力的含义。

2．比较级分Ⅰ和级分Ⅱ的比活力，试分析级分Ⅱ比活力高的原因。