对虾抗病性状遗传标记的分析

在世界范围内已经陆续开展中国对虾、蓝对虾、日本囊对虾、斑节对虾和凡纳滨对虾等主要养殖种类的品种选育和健康养殖等研究工作（Pruder et al，1995；Wyban et al，1995；Carr et al，1994）。采用的技术主要以经典的选择育种技术和现代分子生物学技术的有机结合。法国海洋开发研究院已经从蓝对虾种群中找到10个微卫星标记，从斑节对虾中找到3个微卫星标记，这些标记在识别混养的不同家系时发挥了作用。澳大利亚联邦科学和工业研究院也已经成功地从日本囊对虾中找到3个可能与生长表现相关的基因位点，并有可能进一步开发为可预测生长的基因标记。美国在凡纳滨对虾高健康和无特异病原虾品系的培育中运用RAPD技术，对各品系的群体遗传变异水平进行了检测，并成功地筛选出一些特异性标记（Carcia et al，1996；Alcivar-Warren et al，1997）。中国对虾是我国的主要海产捕捞对象和水产养殖的重要虾类之一，但近十年来出现的病害肆虐、规格下降等问题已严重制约着养殖业的发展。遗传标记技术的研究目前起步较晚，且大部分为种群遗传多样性的研究。关于对虾群体特异性遗传标记的报道较少，针对对虾经济性状相关的遗传标记的研究尚未见报道。刘萍等（2002）采用随机扩增多态DNA技术分析了对虾抗病性状的遗传标记，尝试与经济性状相关的数量性状与DNA分子遗传标记建立连锁关系，为进一步将与经济性状有关的基因进行定位、克隆奠定基础。

本研究共对220个随机引物进行筛选，得到与抗病性状相关的特异性遗传标记98个，其中中国对虾抗病群体特异性片段出现18个，片段大小在460～2.3.5　bp之间；凡纳滨对虾抗病群体特异性片段产生81个，片段大小在435～2.2.7　bp。

在220个随机引物中，77个引物在两种对虾的抗病群体中扩增出特异性遗传标记。4个引物均获得了3个特异性片段；13个引物获得了两个特异性片段，其余61个引物均获得了1个特异性片段。

图14　两种对虾的RAPD扩增结果

表30　RAPD技术对对虾抗病群体遗传标记的筛选

续表

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RAPD技术是一种研究基因组遗传标记的方法，具有相对简便、易于操作，省时省力，无需专门设计引物，产物遗传多样性丰富等优点。模板DNA经94 ℃变性解链后，在较低的温度下（低于40 ℃）退火，这时形成的单链模板会有许多位点与引物互补配对形成双链结构，完成DNA合成，即产生片段大小不等（200～4.0.0　bp）的扩增产物。扩增产物片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性，据此可以根据扩增谱带的差异而将同一物种的不同性状区分开来。本试验中使用220个随机引物，77个引物两种对虾的抗病群体扩增出特异性遗传标记，不同的引物所获得的特异性遗传标记数不同，仅仅4个引物均获得了三个特异性片段，13个引物获得了两个特异性片段，其余61个引物均获得了1个特异性片段。其次，本试验所得到的可能与抗病性状相关的特异性遗传标记98个，其中中国对虾抗病群体特异性片段出现了17个（片段大小在460 bp～2.3.5　bp），凡纳滨对虾抗病群体特异性片段产生81个（片段大小在435 bp～2.2.7　bp），造成两种对虾抗病群体特异性片段数目上产生较大差异的原因，主要是：① 中国对虾野生群体本身遗传多样性低于凡纳滨对虾野生群体（Garcia et al，1994a，b），中国对虾朝鲜西海岸群体的多态位点为39%，黄渤海群体的遗传多样性更低，多态位点为36.8%，而凡纳滨对虾的多态位点高达39%～77%。因而，凡纳滨对虾群体间的遗传标记容易筛选，虽然中国对虾经过了第3代人工选育，而凡纳滨对虾仅仅进行了第1代选育，但这些并不足以影响其本身的遗传多样性；② 凡纳滨对虾抗病组的特异性片段部分是与对虾抗病性状相关的遗传标记，而部分为显示群体间的遗传标记。因而若想得到与对虾抗病性状紧密相关的特异性片段，尚需进行克隆、测序筛选，进一步的研究工作正在进行中。

我们经过近年来的人工选育，现在已经选育出生长速度快的第五代群体和抗WSSV病毒病的第4代群体，这些人工选育的对虾已显示出良好的生长特征和抗逆性。并应用现代分子生物学技术快速确定优良性状的分子标记，结合遗传学原理，可缩短良种选育周期，在短期内培育出优良品种。筛选生长速度快和抗病力强的对虾品系，是实现集约化养殖的根本基础，也是人们不懈追求的目标。筛选与保存高产、优质、抗逆的种质，是把我国对虾养殖业推向新的台阶必不可少的重要的环节。