农杆菌介导的烟草转基因方法

实验六　农杆菌介导的烟草转基因方法

【实验目的】

1.通过本实验使学生掌握烟草的叶盘转化方法。

2.掌握植物细胞培养中的无菌操作技术和无菌苗再生技术。

【实验原理】

根瘤农杆菌可以侵染受伤的植物组织和细胞。经过农杆菌侵染后的植物细胞和组织可以分化出苗，然后通过抗性筛选获得转基因植株。

【实验材料】

烟草无菌苗的准备:将烟草(Nicotiana tabacum L-cv wisconsin 38)种子置于75%乙醇中，30秒后用无菌水清洗，之后再用50%安替福明溶液消毒30分钟，用无菌水洗5遍。将灭菌后的种子平铺于MS固体培养基(pH 5.8)上，琼脂浓度为0.8%。待长出小苗后，将小苗转移到培养盒中继续进行无菌培养，直到长出若干叶片后备用。

【实验器材】

1.恒温摇床和恒温培养箱:培养农杆菌。

2.超净工作台:接种和转化植株。

3.高压灭菌锅:培养基灭菌。

4.离心机和离心管:收集农杆菌。

5.大平皿、手术刀和镊子等用具。

【药品试剂】

1.YM培养基:详见第一部分第二节实验四农杆菌培养、感受态细胞准备和质粒转化。

2.MS培养基:详见第四部分实验三十三植物培养基的配制。

3.烟草生芽培养基: MS培养基、0.59g/L MES、3%蔗糖、6～7g/L琼脂粉，灭菌后加入2.0g/L甘氨酸、1000倍稀释的维生素、1000倍稀释的NAA和BAP; pH 5.8～6.0。

BAP(2mg/ml):称取100mg BAP，用几滴1mol/L KOH溶解，蒸馏水定容到50ml。

NAA(1mg/ml):称取100mg NAA，用1ml乙醇溶解，再加入3m l 1mol/L KOH，然后用1mol/L HCl定容到6m l，最后用蒸馏水将溶液定容到100ml。

4.烟草抗性筛选培养基: MS培养基、0.59g/L MES、3%蔗糖、6～7g/L琼脂粉，灭菌后加入2.0g/L甘氨酸、1000倍稀释的维生素、1000倍稀释的NAA和BAP、500mg/L羧苄青霉素和300mg/L卡那霉素; pH 5.8～6.0。

5.烟草生根培养基: MS培养基、0.59g/L MES、3%蔗糖、6～7g/L琼脂粉，灭菌后加入甘氨酸至终浓度为2.0g/L、1000倍稀释的维生素、200mg/L羧苄青霉素、100mg/L卡那霉素; pH 5.8～6.0。

【实验方法】

1.无菌苗的准备，方法见实验材料部分。

2.农杆菌的培养:接种LBA4404(含有目的基因的双元质粒，农杆菌感受态的准备和重组质粒的转化方法同前)于固体培养基上，2天后挑取单菌落于50m l YM液体培养基中，200r/min，28℃，生长42～48小时至OD₆₀₀为1.0左右。3000g离心收集农杆菌，用MS液体培养基悬浮农杆菌至OD₆₀₀约0.5。

3.烟草叶盘转化和共培养:取无菌苗叶片，保留中脉，切成0.25cm²大小的叶盘，在预培养基(MS+ MES 0.59g/L 3%蔗糖+ 6～7g/L琼脂粉+ 2.0g/L甘氨酸+ 1000倍稀释的维生素)中培养2天。将预培养后的叶盘于菌液中浸泡10分钟。叶片表皮朝下，置于共培养基上(MS+MES 0.59g/L+NAA 0.1mg/L+ BAP 1mg/L+卡那霉素300mg/L)，每个培养皿中放置6～7片叶盘，光照培养箱中共培养2～3天。

4.筛选并培养再生芽(如图1-2所示):共培养结束后，用液体MS培养基清洗叶片2次，再用添加羧苄青霉素Carb(500mg/ L)的液体MS培养基清洗1次。叶盘转移至选择培养基上(MS培养基+ MES 0.59g/L+ NAA 0.1mg/L+ BAP 1mg/L+卡那霉素300mg/L+羧苄青霉素500mg/L)。每隔15天继代1次。

5.生根培养:待再生芽长至1cm左右时切取小芽移至生根培养基上(1/2MS+卡那霉素100mg/L+Carb 200mg/L)继续在光照培养箱中培养。

6.待小苗生根后，将小苗移栽入蛭石或直接移入土中。

7.十天后移栽入土钵，并进行相关转基因植株鉴定。

【思考题】

1.烟草的转化方法有哪些?其各有哪些优缺点?

2.在配制培养基时，维生素和甘氨酸要通过过滤的方法进行灭菌，而且要在培养基高压灭菌后再加入到培养基中，这样做的原因是什么?

左图为农杆菌浸染后的叶片在筛选培养基上生长;

右图为农杆菌浸染后的叶片在筛选培养基上培养约1个月后生长出具有抗性的小苗。

图1-2　叶盘转化法