实验七 农杆菌介导的水稻转基因方法
水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一。近年来，DNA重组技术、遗传操作技术、水稻基因图谱的研究取得了显著发展，2000年4月美国Monsanto公司和2001年2月Syngenta公司先后宣告完成粳稻日本晴基因组测序草图。我国也已宣布完成籼稻9311的序列框架图。目前，以大规模分离、鉴定基因组序列功能为特征的水稻功能基因组研究正在迅速发展，水稻遗传转化体系的建立和发展对于上述研究工作的进行是至关重要的。水稻遗传转化体系日臻完善，农杆菌介导法、基因枪法、PEG法和花粉管通道法等方法均在水稻遗传转化研究中应用并获得转基因植株。目前采用最多的方法是基因枪法和农杆菌介导法。
农杆菌介导的水稻遗传转化体系非常成熟，在国内外得到了广泛应用，而且不存在严格的基因型特异性，在培养基上预培养2～3天的成熟胚愈伤组织和未成熟胚均可作为外源基因转移的受体材料，其再生能力和转化能力都比较理想，获得成功的农杆菌菌系有LBA4404、A281和EHA105等。此外，基因枪介导的水稻遗传转化体系比较成熟，实际工作中的应用也较为广泛。
【实验目的】
1.学习并掌握农杆菌介导的水稻转基因操作方法。2.学习并掌握水稻愈伤组织培养和幼苗再生方法。
【实验原理】
农杆菌转化水稻的原理与烟草转化的原理相同。转化过程中加入了乙酰丁香酮，可以克服以往农杆菌对于单子叶植物不感染的问题，使转化效率有很大的提高。
【实验材料】
以水稻中花11种子作为实验材料。
【实验器材】
1.恒温摇床和恒温培养箱:培养农杆菌。
2.超净工作台:接种和转化植株。
3.高压灭菌锅:培养基灭菌。4.离心机和离心管:收集农杆菌。5.大平皿、手术刀和镊子等用具。
【药品试剂】
N6大量元素、N6微量元素、维生素和Fe-EDTA的配方和使用方法见实验三十三中植物培养基的配制。
1.诱导和继代培养基: N6大量元素、N6微量元素、2.5mg/ ml 2，4-D、Vitamin、Fe-EDTA、0.6g CH、0.3% phytagel和3% Sucrose，调节pH值至6.0，定容至1L。
2.农杆菌悬浮培养基: 1/2N6大量元素、1/2N6微量元素、2.0mg/ml 2，4-D、Vitamin、Fe-EDTA、0.6g CH、2% Sucrose、1% Glucose和200μmol/L AS，调节pH值至5.2，定容至1L。
3.预培养基和共培养基: 1/2N6大量元素、1/2N6微量元素、2.0mg/ml 2，4-D、Vitamin、Fe-EDTA、0.6g CH、0.8% agarose、2% Sucrose、1% Glucose和200μmol/L AS，调节pH值至5.6，定容至1L。
4.抗性筛选培养基: N6大量元素、N6微量元素、2.5mg/ml 2，4-D、Vitamin、Fe-EDTA、0.3g Pro、0.3% phytagel、3% Sucrose、400mg/L Cef和50mg/L Hn，调节pH值至6.0，定容至1L。
5.分化培养基: N6大量元素、N6微量元素、Vitamin、Fe-EDTA、2% Sucrose、0.6g CH、3mg/L BA、0.2mg/L NAA和0.3% phytagel，调节pH值至6.0，定容至1L。
注: CH:水解酪蛋白; AS:乙酰丁香酮; Hn:潮霉素; Cef:头孢霉素; Pro:脯氨酸; NAA:萘乙酸。
【实验方法】
一、农杆菌感受态的制备
1.将农杆菌EHA105(或其他菌株)划YM平板，26～28℃培养48小时。
2.挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基中，250r/min悬浮培养12～16小时。
3.在超净台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管中，4℃条件下8000r/min，离心8分钟。
4.弃上清液，用100 mol/L NaCl(4℃预冷)重悬农杆菌;
5.4℃，8000r/min，离心8分钟。
6.弃上清液，加入原始菌液1/50体积(800μl)的20 mmol/L CaCl2重悬菌体，分装100μl/管(此时的感受态农杆菌可以直接用于转化)。
7.置液氮中10秒钟，放入－80℃冰箱中保存备用。
二、质粒转化农杆菌
1.将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA(体积不宜超过10μl)，充分混匀，置冰上30分钟。
2.置液氮中1分钟(时间不能过长)。
3.迅速转入37℃水浴中，待其融化。
4.加入1ml YM液体培养基。
5.28℃，230r/min培养2～4小时。
6.3000r/min离心2分钟，将上清液吸去500μl，留500μl于管中。
7.振荡重悬菌体，并涂布到含有适当抗生素的YM平板上，吹干。
8.28℃培养48小时。
9.挑取单菌落接种到液体YM培养基中，28℃，250r/min培养48小时，菌液用于转化。
三、农杆菌的培养和悬浮
1.将农杆菌接种在含有相应抗生素的YM培养基上，28℃条件下，暗培养48小时。
2.在50ml离心管中加入30ml共培养的培养基。然后取灭菌小勺刮取农杆菌，用小勺的背面将菌体贴在管壁上轻轻拍散，使农杆菌悬液的OD600达到0.8～1.0(也可以将培养后的农杆菌接种到100ml的液体培养基中，培养至OD600达到0.8～1.0)。
四、农杆菌转化水稻愈伤组织
1.选择致密、相对干燥的胚性愈伤组织转移到新鲜的N6固体培养基上，28℃条件下暗培养2～4天。
2.把经过前培养的愈伤组织集中至一个平皿中，一次性转入准备好的农杆菌菌液，轻轻转动离心管使得菌液分布均匀，感染时间为15～25分钟。
3.在无菌超净工作台上将菌液倒出，把愈伤组织倒在无菌滤纸上放置2小时左右，保证菌液被滤纸吸干，转移愈伤组织至1/2共培养基，20℃条件下，暗培养2～3天。
4.将共培养的愈伤组织转入50m l离心管中，用无菌水清洗3次以上，至液体较清亮。
5.最后一次倒出无菌水后，加入含有500mg/L头孢霉素的N6液体培养基，于100r/min条件下振荡15～20分钟，重复2～3次。
6.将愈伤组织倒在无菌滤纸上吸干多余菌液，并在超净工作台上吹干2小时以上。将干燥的愈伤组织转入含有250mg/L头孢霉素的N6固体培养基上，28℃条件下暗培养7～10天。
7.将没有被农杆菌污染的愈伤组织转入含有250mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的N6固体培养基上，28℃条件下暗培养15～20天。
8.再一次将愈伤组织转入仅含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基上，28℃条件下暗培养15～20天。
9.将最后一次筛选获得的愈伤组织转入含有50mg/L潮霉素的MS固体培养基上，28℃条件下暗培养12～15天。
10.选出长势良好的淡黄色愈伤组织转移到含有50mg/L潮霉素的MS固体培养基上，光照条件下，28℃培养15～20天，可以看到有绿色的小芽出现，一般15天左右换一次培养基。
11.当绿芽的长度达到2厘米左右时，剥去周围多余的愈伤组织，剪去根，转移至1/2MS生根培养基中继续培养。长出根系后，将再生植株转入培养钵中于蔽阴处培养4～5天。
12.转入大田中培养至成熟。
【思考题】
1.如何获得过量表达某个功能基因的纯合体转基因植株?
2.在农杆菌介导的转基因方法中，影响水稻转基因成功的因素有哪些?
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