病原形态特征与培养特征

第一节　病原形态特征与培养特征

一、病原形态特征

结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1μm×0.4μm～4μm×0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。

在电子显微镜下可见菌体微细结构。结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质组成。

1.细胞壁

厚度为10～35nm，较一般细菌的细胞壁厚。含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。

功能：保护细菌的固有形态，抵抗酸碱物质及宿主细胞对细菌的破坏和杀伤。如果细胞壁有缺陷，细菌只能在高渗环境下生存，则称此类细菌为L型细菌。

2.细胞膜

细胞壁内层围绕于细胞质外的富于弹性的半透膜。主要成分是脂类（磷脂）和蛋白质。

功能：是细菌与外界环境进行物质交换的主要场所，在细胞内一系列代谢活动中起重要作用。

3.细胞质

细胞质是带黏滞性的液体，充满了细胞膜内的整个空间。细胞浆内含有核糖体及其他多种颗粒。

功能：细胞合成蛋白质和核酸等生命活性物质的场所，细菌对营养物质进行同化作用和异化作用的场所。

4.核质

核质由单一双股DNA组成。电镜下由极细的纤维物质所组成，与细胞质不分开，无核膜、核仁。

功能：细胞遗传的物质基础。

5.染色

分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占菌体干重的60%，特别是有大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。因此细菌生长成粗糙的畏水性菌落，而且也很难用一般染料染色；然而设法着色后，又不易用盐酸酒精脱色，这种能抵抗盐酸酒精脱色的细菌被称为抗酸杆菌。革兰氏染色阳性，一般用齐—尼抗酸染色法，以5%石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。荧光染色镜下的抗酸杆菌在暗色背景下呈黄绿色或橙色荧光。

牛分枝杆菌需氧，不运动，无芽孢或鞭毛。菌体两端有浓染的颗粒，其余部分有很多小的颗粒和小空泡，革兰氏染色弱阳性，单个或呈链排列，在生长初期有丝状、卵圆形、球状、双球状等多种形态改变，抗酸染色性亦受菌龄、营养与药物等影响而减弱或转为阴性。

有报道称，近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜，一般因制片时遭受破坏而不易看到。若在制备电镜标本固定前用明胶处理，可防止荚膜脱水收缩。在电镜下可看到菌体外有一层较厚的透明区，即荚膜，荚膜对结核分枝杆菌有一定的保护作用。

结核分枝杆菌在体内外经青霉素、环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，异烟肼影响分枝菌酸的合成，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖，均可导致其变为L型，呈颗粒状或丝状。异烟肼影响分枝菌酸的合成，可变为抗酸染色阴性。这种形态多形、染色多变，在肺内、外结核感染标本中常能见到。临床结核性冷脓疡和组织标本中甚至还可见有非抗酸性革兰氏阳性颗粒，过去称为Much颗粒。该颗粒在体内或细胞培养中能返回为抗酸性杆菌，故亦为L型。

二、培养特征

结核杆菌为严格的需氧菌。最适宜温度为37℃，低于30℃不生长。结核杆菌的细胞壁脂质含量很高，影响营养物质的吸收，故生长缓慢。在一般培养基中每分裂一代需要18到24小时，营养非常丰富的情况下也需要5小时以上。结核杆菌生长营养要求高，在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长良好。也有很多报道称固液双向土豆培养基可以培养结核分枝杆菌。生长最适pH值为：牛型结核菌5.9～6.9、人型菌7.4～8.0、禽型菌7.2。初次分离结核杆菌时，生长缓慢，接种后经3～4周长出菌落。结核杆菌的菌落、毒力及耐药性可发生变异。典型的菌落为粗糙型，干燥、坚硬，表面呈颗粒状，乳白或米黄色，形似菜花，毒力强；而变异菌株菌落则表面光滑，毒力弱。在液体培养基内呈粗糙皱纹状菌膜生长，若在液体培养基中加入水溶性脂肪酸，例如Tween-80，可降低结核分枝杆菌表面的疏水性，使其呈均匀分散生长，此有利于作药敏实验等。

初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏固体培养基，内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般3～4周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明。在液体培养基中可能由于接触营养面大，细菌生长较为迅速。临床标本检查液体培养比固体培养的阳性率高数倍。但是，液体培养对技术要求很高，也比较容易污染。现在常用的液体培养基为7H9，固体培养基为7H10、7H11。