第一节 样品的采集
检测样品是检测工作的源头，所有检测均是以样品为对象，因此，可以说检测样品的质量，决定着检测工作的成败。动物的离体组织、排泄物和体液的实验室诊断分析是其疾病诊断的基本条件，在此基础上结合其他资料进行综合分析，对疾病的确诊、病情发展的预测及防预措施的制定有重要意义。样品能否正确反映机体真实情况与样品的采集过程密切相关，包括样品采集的时机，采集前的准备，采集时动物的身体状态，采集的量、方法及保存等。不恰当的采集过程可能引起疾病的误诊，故正确采集标本是保证诊断正确、治疗无误的最基本的条件。
一、样品采集应当具备的基本条件
1.具有与采集病原微生物样本所需要的生物安全防护水平相适应的设备；
2.具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员；
3.具有有效的防止病原微生物扩散和感染的措施；
4.具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手段。
二、样品采集要遵循的一般原则
1.采集最适病料 理想的病料应是无菌采取的含病原微生物量多的血液、器官组织或分泌物和排泄物。因此，要根据疾病的病性采取合适的病料，如无法估计是何种疾病时，应根据临床症状和病理变化采集病料，或全面采取病料。取材时应注意病原微生物感染所致疫病的类型（如呼吸道感染疫病、胃肠道感染疫病、皮肤和黏膜性疫病、败血性疫病等）、病原微生物的侵入部位、病原微生物感染的靶器官等。细菌学检验病料应当是采自未经抗菌药物治疗的患病动物，并应做几张涂片。
2.适时采集 采集病料的时间一般在疾病流行早期、典型病急性期，此时病原微生物的检出率高；后期由于体内免疫力的产生，病原微生物减少，检测病原微生物比较困难，同时可能出现交叉感染，增加判断的困难性。在采集供抗体测定用的血清时，可适时地采集急性期和恢复期的两份血清样品，一般两份血清的间隔时间为14～21d。内脏病料的采取，需于动物死后立即进行；夏季最迟不超过4～6h，冬天不超过24h，否则时间过长，由肠内侵入其他细菌，致使尸体腐败，有碍于病原微生物的检出。供做切片的样品采取后必须立即投入固定液，否则时间过长，会使细菌和组织细胞死亡、溶解，影响检验结果。有条件做现场细菌培养时，剖开尸体后应进行接种培养，然后采样，最后剖检。
3.无菌操作 采集病料所用的器械及容器要进行严格的消毒。刀、剪、镊子等金属用具可煮沸消毒30min，使用前最好用酒精擦拭，并在火焰上烧一下；器皿（玻制、陶制及珐琅制等）在高压灭菌器或干烤箱内灭菌；软木塞和橡皮塞应高压灭菌；载玻片用2%～5%碳酸钠煮沸消毒5～10min，煮沸后用清水冲洗干净，拭干保存或浸泡于95%酒精中以备使用；注射器和针头放于清洁水中煮沸30min即可，或用一次性注射器。病料采取过程都应该无菌操作，尽量避免杂菌污染。采取一种病料，使用一套器械，或器械用酒精擦拭、火焰灭菌后再采取另一种病料；一种病料放入一种容器，不可混放。
4.剖前检查 凡发现患畜（包括马、牛、羊及猪等）有急性死亡时，如怀疑是炭疽等烈性传染病，则不可随意解剖，应采取患畜的血液，万不得已时局部解剖作脾脏触片的显微镜检查。只有在确定不是炭疽等烈性传染病后，方可进行剖检。动物剖检中应做好人身防护，严防人畜共患病感染。采集病原微生物样本的工作人员应防止污染环境，防止疫病传播，做好环境消毒和动物尸体的处理。并对样本的来源、采集过程和方法等作详细记录。
三、样品采集的基本要求
根据不同的疾病或检验目的，分别采集相应的组织脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料；进行流行病学调查、抗体检测、动物群体健康评估或环境卫生检测时，样品的数量应满足统计学的要求。采样时应充分保定动物，减少对动物的刺激或损害，在保护动物的同时避免对采样者构成威胁。对发病群体在无法通过大体剖检初步判定病因时，可进行全面的样品采集，以备检查之需。所有样品容器上均需做好标注，以防混淆。
供细菌分离用样品的采集：对动物进行病原检查，病料的采集和运送是否得当，是关系到能否分离到病原菌的关键。因此首先应充分了解各种病菌（目的菌）在被检动物体内及其分泌物和排泄物中的分布情况，不同病原菌在患病动物体内分布情况不同，即使是同一种病原菌，在疾病的不同时期和不同的病型中分布也不同。在采取病料前必须对被检动物可能患有何种疫病作出初步诊断。根据国际标准或官方采样程序采样。采取病料所用器械都应事先消毒，确保无毒无菌，采样时应无菌操作。为了提高病原微生物的阳性分离率，采取的病料要尽可能齐全，除了内脏、淋巴结和局部病变组织外，还应采取脑组织和骨髓，以防遗漏；认真填写好病料送检单和剖检病理变化记录。
采集用于病毒分离样品，其原则是尽可能采集新鲜样品。最理想的时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。濒死动物的样品，或死亡之后立即采集的样品也有利于病毒分离。采集样品的选择一般是：呼吸道疾患采集咽喉分泌物；中枢神经疾患采脑脊髓液；消化道疾患采集粪便；发热性疾患和非水疱性疾患采集咽喉分泌物、粪便及全血；水疱性疾患采集水疱皮和水疱液。若是尸体剖检后采集样品，一般是采集有病理变化的器官或组织。不同的病毒病采集的样品各有不同，样品的采集对于疾病的检测与定性非常重要。
四、不同样品的采集方法
（一）血液样品的采集
供检验用的血液样品，一般采集静脉血，大动物可采集多量的血液，而小动物和实验动物的采血量少，只能根据检验的目的、动物种类和病情酌定采血量。一般根据检测项目的方法和对标本的要求不同，临床检验采用的血液标本分为全血、血清和血浆。全血主要用于血细胞成分的检查，血清和血浆则用于大部分临床化学检查和免疫学检查。
1.细菌分离用血液的采集 要全血时，无菌采取血液10ml，立即注入盛有含0.5%肝素溶液0.1ml或7%柠檬酸钠液1ml的灭菌试管内，并立即混合均匀。分离血清时，将无菌采取的血液直接注入灭菌试管，待血液自然凝固后分离血清。从尸体采取血液时，可用灭菌注射器或吸管从右心房抽取。
2.病毒分离用血液样品的采集 每个病畜抽取10～15ml全血，使其自然凝固分离血清。将血清置灭菌瓶中于低温冰箱中保存。待2～3周后再抽血一次分离血清。有时也用柠檬酸钠或肝素抗凝血或脱纤血进行病毒分离或血细胞分类。
3.静脉采血
（1）牛、马、羊的采血：以颈静脉穿刺最为方便。应在颈静脉中1/3与下1/3交界处剪毛、消毒，术者应紧压颈静脉下端，待血管怒张时，用针头对准血管刺入，即可获得血液样品。此外奶牛可在腹壁皮下静脉采血，牛可在尾中静脉采血。
（2）猪一般从耳静脉采血：方法是将耳根捏紧，待静脉显露出来，在此局部消毒，用较细的针头刺入血管即可抽出血液样本。如所需血液量大或特殊需要可在前腔静脉穿刺采血。其方法是：将猪仰卧保定（仔猪或中等猪）或站立保定（肥育猪），将两前肢向后拉直或用绳环套住上额拴于柱栏内，在左侧或右侧胸前窝消毒，针头斜向对侧或向后内方与地面呈60°角，刺入2～3cm即可抽出血液。采血后应用酒精棉花压紧采血部位止血。
（3）鸡常在翅内静脉采血：用细针头刺入静脉，让血液自由流入集血管内，不可用注射器用力抽取，以防引起静脉塌陷和出现气泡。
4.末梢采血 适用于需血量少且采血后立即进行检验的项目，如涂制血片，血细胞计数，血红蛋白测定，出血时间和凝血时间的测定等。马、牛在耳尖部；猪、羊在耳边缘；对仔猪和某些小动物也可剪去尾尖部采得血样。
5.心脏采血 适用于家畜及某些小动物需要多量血液时。通常是右侧卧保定，在左侧胸部触摸心搏动最明显的地方进行消毒、穿刺，连接注射器吸取血液。
6.血液的抗凝 全血若需抗凝血，则视实验要求选择抗凝剂（肝素、EDTA、阿氏液、枸橼酸钠）。采集全血或血浆样品时，在采血前应在采血管中加入抗凝剂，制备抗凝管。如用注射器采血，应在采血前先用抗凝剂湿润注射器。
7.血样的处理
（1）血清：将采集的血液在室温下静置2～4h（防止曝晒），待血液凝固后分离血清。若需长时间保存，则将血清置20℃以下保存，但要尽量防止或减少反复冻融。
（2）血浆：采血试管内先加上抗凝剂，血液采完后，将试管颠倒几次，使血液与抗凝剂充分混合，然后静止，待细胞下沉后，上层即为血浆。
采血剂量：小动物1～2ml，中等以上动物5ml或以上。
（二）眼、呼吸道、咽、肛拭子的采集
用灭菌的棉拭子采集眼结膜、鼻腔、咽喉或气管内的分泌物，蘸取分泌物后立即将拭子浸入保存液（50%甘油生理盐水，没过拭子即可）中，密封低温保存。或将消毒拭子插入动物肛门或泄殖腔中，采取直肠黏液或粪便，放入装有缓冲液的容器中，尽快送到实验室。
（三）子宫阴道内分泌物或外生殖器包皮内分泌物的采集
消毒好的特制吸管插入子宫颈口或阴道内，向内注射少量营养液或生理盐水，用吸球反复抽吸几次后吸出液体，注入培养液中。用软胶管插入公畜的包皮内，向内注射少量的营养液或生理盐水，多次揉搓，使液体充分冲洗包皮内壁，收集冲洗液注入无菌容器内。
（四）实质脏器的采集
无菌采集脏器组织块，放入无菌容器内。每块组织应单独放在无菌容器内，注明日期、组织和动物名称。注意防止组织间相互污染。供组织病理学检查的样品要新鲜、不能冷冻，不要挤压，尽量避免造成人为损伤。取材应包括病灶及周边正常组织，组织块的厚度最好不超过1.5cm，要有切面，取材后应及时固定于10%福尔马林溶液中。如作冷冻切片用，则需将组织块放在0℃～4℃容器中，尽快送实验室检验。供病毒分离用组织器官样品死后立即采集，直接放入灭菌瓶中，不加防腐剂。若样品不能当天使用，有些可用50%的缓冲甘油（pH值为7.2的Hank’s平衡盐溶液或PBS配制，含复合抗生素）保存。绝大多数病毒是不稳定的，样品一经采集要尽快冷藏。现场采集样品要尽快用冷藏瓶（加干冰或水冰）将样品送到实验室检验或置低温冰箱保存。如使用干冰应特别注意将样品严密封好，以防二氧化碳（CO2）窜入样品，因为有的病毒对酸很敏感（如口蹄疫病毒）。如无法获得干冰或水冰，可用冷水加氯化铵按3∶1的比率倒入冷藏瓶中，溶解后将密封好的样品放入其中。不能得到及时检验的样品，一般要保存于－70℃以下。一般忌放－20℃（该温度对有些病毒活力有影响）。
（五）体表样品的采集
表皮寄生虫检查，可刮取病变组织碎屑或用透明胶带粘取内耳、耳根及颈背部毛根部皮屑，贴附于载玻片上，供显微镜检查（需尽快进行观察，以免虫体爬出）。产生水泡或皮肤病变的疾病，应直接从病变部位采样。可直接收集病变皮肤的碎屑以及未破裂水泡液、水泡皮等作为样品，液体采集后置离心管内，水泡皮等置于灭菌的50%甘油盐水保存液中低温保存送检（液体没过组织即可）。
（六）乳汁样品的采集
清洗乳头后采样。乳房先用消毒液洗净（取乳者的手亦应事先消毒），并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的3～4把乳汁弃去，然后再采集10ml左右乳汁于灭菌试管中。进行血清学检验的乳汁不应冻结、加热或强烈震动。
（七）胚胎的采集
选取完整、无腐败的胚胎置于冰盒中尽快送抵实验室。如果在24h内不能将样品送达实验室，需先冷冻后运送。
（八）精液、尿液及其他液态样品的采集
精液样品用人工方法采集，所采样品应包括“富精”部分；尿液宜在早晨采集，在动物排尿时，用洁净的容器直接接取。也可使用塑料袋，固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取尿液。
采集胆汁、脓、黏液或关节液等样品时，用灭菌吸管、毛细吸管或注射器插入蓄积部位，吸取液体物质，然后将其注入灭菌的试管中送检。
（九）粪便样品的采集
检查消化系统寄生虫，需采取5～10g新鲜粪便。从体外采集粪便，应力求新鲜。或用拭子小心地插到直肠黏膜表面采集粪便，然后将拭子放入盛有灭菌的50%甘油盐水保存液中送检（如做虫卵检查，应用饱和盐水浮游法或离心集虫法尽快进行）。
（十）供显微镜检查的脓、血液、黏液及组织抹片的制备方法
先将上述样品置于载玻片上，再用另一玻片推抹或滴加盐水后用另一玻片涂抹，涂片自然干燥后，火焰固定按实验要求进行染色后观察。用组织块作触片时，将组织块的游离面在玻片上轻轻蘸抹即可（涂布样品切记要薄，如细胞重叠，将影响观察结果）。滴加生理盐水后用做暗视野检查或直接镜检的样品，应立即在显微镜下观察。
（十一）全脑、脊髓的采集
切开颅骨，采取脑、脊髓，做病原检查，可将脑、脊髓浸入50%甘油盐水液中，低温状态下送往实验室。做病理学检查，可固定于10%福尔马林液中送检。
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