细胞传感器

12.4　细胞传感器

12.4.1　概述

近几年，随着半导体微细加工技术的发展，分析技术的微型化为细胞微环境分析提供了强有力的手段，以活细胞作为敏感元件已成为生物传感器研究领域的一大热点。细胞传感器（Cell-based Biosensor）是以活细胞作为探测单元的生物传感器。

细胞传感器能定性定量测量分析未知物质的信息，即确定某类物质存在与否及浓度大小。例如，把具有某一类型受体的细胞当作传感器，由受体-配体的结合常数可推导出该传感器对某类激动剂的敏感度，测量该传感器的响应就可以定量测量该激动剂的浓度。更重要的是，细胞传感器能够测量功能性信息，即监测被分析物对活细胞生理功能的影响，从而能解决一些与功能性信息相关的问题。例如:复合药物各成分对生理系统的影响是什么；被分析物相对于给定的受体是否是抑制剂或激动剂（这是现代药物筛选和开发的核心问题）；被分析物是否以其他方式来影响细胞的新陈代谢，如第二信使或酶；待测物是否对细胞有毒副作用；环境是否受到污染。

总之，利用细胞传感器可以连续检测和分析细胞在外界刺激下的生理性能。从生物学角度来看，它能够探求细胞的状态功能和基本生命活动；从被分析物的角度来看，它能够研究和评价被分析物的功能。尽管使用活细胞作为传感器的敏感元件会产生很多复杂的问题，如细胞类型的选择，细胞的培养，细胞活性的保持，细胞与传感器的耦合等；但该类生物传感器能够完成实时动态快速和微量的生物测量，在生物医学、环境监测和药物开发等领域具有十分广阔的应用前景。

12.4.2　细胞传感器的分类及原理

细胞传感器的种类较多，工作原理不尽相同。一般可按照从细胞获得的信息情况对细胞传感器进行分类。下面，我们主要介绍一些典型的细胞传感器。

1.监测细胞内外环境的细胞传感器

实时活体监测细胞是全面了解细胞生理性能及其机制的重要基础，这就要求能够定量测量和分析细胞的内外微环境。测量细胞内自由离子浓度的较好方法是采用离子敏感微电极（ISME），组合不同的ISME可以并行测量细胞内多种离子，如NH^4＋、Cl^-、Na^＋和Mg^2＋等。此外，荧光成像也是细胞内微环境监测的一种有用的工具，可测量与细胞信号传递有关的离子浓度蛋白表达的变化。荧光探针和共聚焦显微技术（细胞三维切片扫描）的结合，使细胞结构和功能的分析可达到前所未有的精确性和清晰度，能更好地测量细胞内各种离子浓度（游离Ca^2＋和胞内H^＋等）。

细胞内生理状态的改变会引起细胞外代谢物（如离子生物大分子等）的相应变化。因此，测量细胞代谢后胞外微环境的相关参数，可以间接监测细胞的生理变化。

20世纪90年代，美国分子器件公司（Molecular Device Corporation）把芯片技术引入生物学领域，开发出了一种细胞微生理计（Microphysiometer）:用建立在硅技术基础上的传感器检测细胞酸化的微环境。细胞由于能量代谢产生酸性物质，使外环境酸化，利用光寻址电位传感器（LAPS）可以测量细胞外微环境的pH值变化，定量计算细胞H^＋排出速率，从而可以分析细胞的代谢率。这种方法对糖酵解和呼吸作用的代谢过程都适用。除了利用LAPS测量酸化率，也用H＋敏场效应管（ISFET）来测量细胞外代谢率。此外，利用氧电极传感器和CO₂传感器可以测量在糖酵解过程中，O₂的消耗量和CO₂的生成量。

大量的配体-受体结合实验表明，功能受体与激动剂相结合会引起细胞酸化率上升。根据酸化率这一指标，细胞微生理计就可以测量化疗药物对肿瘤细胞的药效，实现高通量的药物评价和筛选。

目前，监测细胞外环境的传感器技术虽然获得了快速的发展，但监测到的变化是细胞群的总体效应，如果对单个细胞进行详细的分析，则需要更多的细胞生理信息。此外，由于实验条件和实验目的不同，细胞内外环境的测试数据缺乏可比性。若能将对内外环境的两种监测手段结合起来，即在监测细胞外环境的同时，监测细胞内环境相关因子的变化，则将更有助于了解生物物质在跨膜时的运动机理以及药物对细胞的作用机制。

2.监测细胞电生理行为的细胞传感器

可兴奋细胞的电生理信号与细胞功能性信息紧密相关。可兴奋细胞，如神经细胞、肌肉细胞和内分泌细胞等，均能产生动作电位响应外界刺激（如光电药物等）。直接测量细胞膜电位的基本方法是采用膜片钳（Patch Clamp）技术。但这种方法无法同时测量不同位置的动作电位，不能实现细胞间的耦合测量。而且，细胞内记录和电压敏感材料对细胞是有损的，限制了传统的电生理测量方法的应用。因此，用微细加工技术制作的平面微电极阵列（MEA）或场效应管阵列应运而生，它能无损同步地记录多个可兴奋细胞或组织的动作电位的传播。这类传感器不仅可以研究神经元的电生理现象，也能研究细胞间的通讯。

图12-11显示了斯坦福大学集成中心制作的36个直径为10μm的平面微电极阵列。利用标准的薄膜光刻技术刻蚀微电极和引线。图12-12是用这种阵列同步记录的单层鸡胚胎心肌细胞的动作电位。如图12-11，在第36个电极处生长的细胞给予一定的刺激，阵列中的各电极就会记录兴奋在细胞层中的传播情况，可以看到图12-12中第36、29、25个电极对应细胞层中的不同位点，所以记录曲线的脉冲尖峰有不同程度的延迟，两点之间距离越大，延迟的时间越长。由实验的数据可估计出，这种速率为100mm/s，与细胞内测量相比，这种细胞外记录系统有个明显的优势:能直接测量传播速率。

平面电极阵列也可以用来记录脊椎动物神经元和哺乳动物神经元的细胞外电位，测量神经元对不同物质的响应。尽管长时间的细胞外记录会由于神经细胞或切片发生形态的变化（变瘦和细胞移动）而发生漂移或模糊，但可以通过信号处理来消除这种漂移，或者也可以建立神经细胞-硅耦合的等价电路模型来分析信号发生畸变的原因。Vassanelli等人所建的模型解释了记录到的老鼠胚胎神经元细胞外电位幅度偏低的原因，说明神经细胞外电位的差异可能归因于与电极接触到的局部细胞膜的离子电导的差异。大量的神经细胞外记录信号在药物筛选中有着极其重要的作用，Morefield等人把老鼠胚胎的耳皮质神经元培养在电极阵列上，定量测量不同浓度AN（一种抑制兴奋的药物）作用下神经元的响应，对该类药物进行评价。

图12-11　微电极阵列

图12-12　同步记录的心肌细胞电位

与膜片钳技术相比，这类监测细胞电生理行为的传感器的最大优点是可以对细胞间的信号耦联传导进行长期实时无损的测量。膜片钳的发明者之一德国细胞生物学家Neher指出，活细胞与硅器件的结合是可行的。该项技术仍然处于起步阶段，还存在一些难以解决的问题，例如长期溶液浸泡产生的基底表面腐蚀，细胞附着过程产生的游走移动，细胞与基底之间间隙难以控制，这些都会导致测量的准确性下降。目前主要采用的技术途径是，改进基底的表面粗糙度处理技术和表面周期性清洗，以保证细胞的附着和降低器件表面的腐蚀。此外，提高电极阵列的集成度，使一个细胞对应多个电极，可以提高测量的精度和可靠性。

3.监测细胞力学行为的细胞传感器

许多效应因子可以改变活细胞的性能或特性。例如，一些细胞对于荷尔蒙刺激会产生移动，某些种类细胞的病毒感染将会引起细胞骨架的变化。因此，活细胞力学性能的监测，可以提供一种测量效应因子生物活性的方法。这种传感器在商业上有很大的应用潜力，同时也为研究活细胞的力学性能和响应提供了一种新的研究工具。

图12-13　测量细胞力学性能的传感器

Antonik等人利用微细加工技术蚀刻出长为200μm，宽为30μm，厚为0.6μm，刚度为0.001～0.5N/m的悬臂梁，如图12-13所示。通过特殊的生物学处理，把MDCK细胞培养在该悬臂梁沉积有Si₃N₄的一侧。细胞的机械活动会引起悬臂梁的偏转，将激光束照射在悬臂梁溅射有金薄膜（有良好的反射特性）的一侧，反射光由对位置敏感的光电二极管来接收，可以在纳米量级检测到这种偏转。MDCK细胞在不同毒素的刺激下，悬臂梁发生不同程度的偏转。实验结果初步表明，这种集成细胞的悬臂梁可以实时监测活细胞的力学性能。

贴壁生长在电极上的细胞形状和运动状态的变化，都会引起贴壁界面阻抗的变化。Giaever等人根据这一贴壁界面电特性，设计了能实时连续定量跟踪哺乳动物细胞形状变化的细胞传感器。从理论上来讲，阻抗技术可以在纳米水平对细胞的运动进行动态测量，比传统测量方法的分辨率要高得多。目前，细胞贴壁生长电极已经被用于监测不可兴奋细胞（包括巨噬细胞内皮细胞和纤维原细胞）的力学性能，如形态分布黏附性和运动性等。效应因子作用于细胞时，细胞内部会产生一系列新陈代谢的级联反应，从而细胞进行调整使之适应这种变化，这种反应决定了细胞的整体响应。如果需要检测该反应链上任意一个或一组反应，上述检测传感器也可以满足这种要求。因此，这种传感器为细胞生理检测提供了一条新途径。

4.并行监测多种参数的细胞传感器

细胞传感器种类很多，原理各异，适用条件不尽相同，但毕竟功能较为单一，只能测量某种或某类参数。因此，实现多参数的并行测量是细胞传感器发展的一大方向。

德国Baumann等人开发出一个细胞监视系统（CMS），这种仪器集成了氧、温度、pH、光纤和固定化酶传感器，前两种传感器用来保持正常细胞的生存环境，后三种传感器用来测量细胞外微环境，并采用了CCD来监测细胞的形态。

浙江大学生物传感器实验室设计了基于MLAPS（多光源电位寻址传感器）的多功能细胞微生理计，如图12-14所示。该多功能细胞微生理计的基本原理如下:在LAPS表面采用硅微机械加工和PVC成膜技术，沉积不同的离子敏感膜，用多个不同频率的调制光分别照射LAPS相应的多个敏感膜（如K^＋，Ca^2＋，H^＋和Cl^-等），所测量出的光生电流（电压）包含了多种敏感膜的响应，由计算机采用数字补偿和动态频谱分析等信号处理方法，把多种离子响应分离出来，同时计算出多种离子浓度的变化率。该仪器带有一个流体控制系统，由泵和阀门控制培养液以一定的时间间隔流过培养有细胞的微测量腔，以保持细胞的活性。使用这个系统，他们研究了苯妥英钠苯巴比妥纳和青霉素钠对乳鼠心肌细胞离子通道的影响。实验表明，它可以用来监测正常细胞或病变细胞在各种药物作用下的微环境变化，包括酸性代谢产物和胞外多种离子，估计药物作用对细胞代谢的刺激或抑制效应，从而进行药物评价和药理探索。

图12-14　多功能细胞微生理计的结构图

5.基于生物微电子机械系统的细胞传感器

近几年，随着半导体微细加工技术的发展，能在更小尺寸上加工微型元器件，把光元件微电子和微机械集成在一起，构成性能更稳定的生物微电子机械系统（Biological Micro Electro-Mechanical Systems，BioMEMS），进一步结合微进样、微分离技术，可以改善细胞传感器的性能和功能，减少所需的样量，实现进样的自动化，减少所需的细胞数目直至进行单细胞测量，提高灵敏度，提高时间和空间分辨率。采用传统微细加工技术获得的微电极阵列（MEA）已经得到了广泛应用，这种电极的优点是显而易见的。若把微泵微阀和信号处理电路以及微电极阵列（MEA）集成在硅器件上，则从样品的选择、进样流动和信号处理、传输显示都实现了微型化智能化，这便是典型的基于BioMEMS的细胞传感器。Baxter等人利用硅微机械技术在硅片上集成了八通道的细胞代谢测量系统，可以实现高通量的药物筛选。

半导体材料有很多特性，尽量地把这些特性和细胞分析相结合，可以研制出更多类型细胞传感器。Verhaegen等人为测量细胞能量代谢过程中释放的微能量，按照标准的集成电路微细加工技术在硅片上加工出了两个绝热的独立的微测量腔，如图12-15所示，分别连接在微热量计的冷热两端。热量计由666个铝/P^＋多晶硅热电偶组成，热量和温度的灵敏度分别为23V/W和130mV/K。两个测量腔都加入了100μL的培养液。

图12-15　基于BioMEMS能量代谢细胞传感器

主测量腔培养了约106个爪蟾（A6）肾细胞，而参考测量腔中没有培养细胞。40分钟后达到了热平衡。经测量，平均每个细胞基础能量代谢为330pW。当降低测量腔渗透压浓度50%（两个测量腔都再加入100μL的培养液）来刺激细胞膜转运机制时，单个细胞的能量代谢增加了40pW；若加入1μL浓度为0.2U/mL的催产素后，单个细胞能量代谢增加到436pW。

6.利用基因设计的细胞传感器

细胞在被分析物的作用下，监测到的新陈代谢力学性能和电生理性能的改变都是大量生化途径作用的综合效应。这就相当于在测量中引入了“串扰”，因而无法确定被分析物的作用途径，也难以确定真正起作用的细胞响应部位。单靠改进传感器和信号处理方法，难以从根本上解决这个问题。随着分子生物学的发展，可以通过改进主传感器（细胞）的方法来解决。在基因层次上设计细胞，增加它对作用路径的敏感性，或降低它对干扰信号的敏感性，都能大幅度降低串扰。在感兴趣的生化途径上对关键单元进行基因编码，一般是插入或抽出细胞的基因组，增强或降低细胞对作用路径的响应，即可增强或降低串扰。如:去除细胞上某些可疑受体，即把那些我们认为对某一响应起作用的受体击出，使细胞成为击出（Kick Out，KO）细胞。任何对击出受体起作用的生物试剂都能在正常细胞中产生响应，在KO细胞中则不能。将激动剂分别作用于普通细胞和KO细胞中，做对照性实验，就可以定位真正起作用的受体。

Aravanis等人研制了这种利用基因设计的细胞传感器。首先，在微电极阵列上培养3种老鼠心肌细胞:正常细胞（WT）、去除了β₁-肾上腺素受体的细胞（β₁-ARKO）和去除β₂-肾上腺素受体的细胞（β₂-ARKO）；然后，添加β₁-肾上腺素受体激动剂:异丙去甲肾上腺素（ISO），用微电极阵列测量激动剂作用后3种细胞膜动作电位（AP）的变化，输出结果如图12-16所示。在加入ISO后，β1-AR KO细胞的膜外动作电位几乎没有变化，而β2-ARKO细胞和正常细胞（WT）都有很强的响应，从而证实了ISO的作用靶位是β1-肾上腺素受体。

这种改变细胞的基因设计，将串扰转换为普通模式的可去除噪音的方法，已经取得了一定的成功。但是这项新技术还存在一些问题，如单个受体的缺失可能会对细胞的调节功能产生巨大的影响，细胞甚至会发生变异，从而导致功能分析的准确度下降，甚至产生错误的结论。尽管如此，这种基于基因设计的细胞传感器还是为药物筛选提供了一个新方法。

图12-16　利用基因设计细胞传感器的输出结果

12.4.3　细胞传感器的发展趋势

尽管细胞传感器从生理研究到药物筛选都得到了很广泛的应用，但是，还有几个主要的因素限制了细胞传感器的进一步应用，比如再生性和细胞的选择等。随机培养的可兴奋细胞尽管寿命长且粘附性好，增强了细胞与微电极的耦合，然而，缺少载体理化因素的影响，随机培养的神经元形成一个随机的神经网络，以致于难以分析。微电极阵列上的氧化层可能会限制培养在它上面的神经元的神经传导。近年来，细胞模式识别的进展或许能成功引导可兴奋细胞的生长，提高细胞传感器的可重复性。显然，不可能使用细胞传感器来研究所有的细胞和所有的生物活性物质。可兴奋细胞虽然比较通用，但仍需探讨其他类型的细胞。只有全面了解细胞传感器的适用范围，才能更好地设计和使用细胞传感器。细胞传感器要真正进入市场，还需要解决许多问题。比如，微电极阵列中有效的电极数量仍然偏少，信噪比偏小，数据分析量大，对复杂的神经生物响应机理认识不够，在实验室以外的环境中难以有效地应用。

细胞拥有并表达着一系列潜在的分子识别元件，如受体离子通道酶等，这些分子都可以作为靶分析物，当它们对外界刺激敏感时，就按照固有的活细胞生理机制进行相应的生理功能活动。所以，以活细胞作为探测单元的生物传感器可以响应许多具有生物活性的被分析物。此外，细胞传感器具备功能性分析的优点，有助于更深入地探求细胞的生理活动，它已成为生命科学以及环境科学领域必不可少的工具。