链霉菌发酵条件优化及在农作物上的应用

链霉菌005发酵条件优化及在农作物上的应用

谭之磊¹　王来福²　肖湘政²　杨则媛²

（1.天津科技大学生物工程学院天津工业微生物重点实验室　天津　300222；

2.河北省科学院微生物研究所保定071051）

摘要：本文研究了链霉菌菌株005的摇瓶发酵培养基和发酵条件及其对小麦、玉米生长发育的影响。从5种发酵培养基中筛选出4号培养基较适合005菌株的生长。以4号培养基为基础进行L₉ （3⁴）正交试验，筛选出了005菌株的最适生长培养基，菌体干重达48.3g/l，约是优化前4号培养基产量的3倍。链霉菌JW005发酵液不同用量试验结果表明该菌株对小麦出苗有明显刺激作用，株高显著增加。玉米株高、根重、叶面积、地上部分干重均有提高。

关键词：链霉菌，发酵条件，微生物肥料

生物肥料是指以微生物生命活动导致农作物得到特定肥料效应的制品，国际上对广泛应用于农业生产的菌肥称为生物肥料（Biofertilizer） ，我国称之为微生物肥料（Microbial fertilizer） 。在农业生产中推广应用微生物肥料，成本低廉，可以减少环境污染，保护生态环境^[1]。微生物肥料与化肥、有机肥等混合施用，比传统施肥增产的报道占98%，其中增产幅度超过5 %的报道占87.4 %，超过10%的占56.6%^[2]。目前已经研究制定了各类微生物肥料标准草案18个，产品类标准数量覆盖了市场上的主体产品，涵盖率超过70%，为规范生物肥料生产和质量监督管理提供了技术依据；菌种和产品安全标准已在行业中全面采用，使生物肥料生产和应用得到保障；农用微生物产品标识和生产技术规程正在行业中迅速推广应用。这些标准的制定与颁布实施，对确保生物肥料质量安全及其市场规范具有十分重要的作用^[3]。目前，微生物肥料按其制品中特定的微生物种类可分为细菌肥料（如根瘤菌肥） 、放线菌肥料（如5406） 、真菌类肥料（如菌根真菌）等，这种分法既简单又便于理解，但很难从名称上就知悉其作用，因而不利于实际应用；以微生物肥料的作用机理可划分为根瘤菌肥料、固氮菌肥料、解磷菌类肥料、解钾菌类肥料、外生菌根菌肥料等，这种分法功能明确，便于推广，目前较为普及实用^[4]。许前欣等通过多茬定位试验，对微生物肥料的肥效及促进农作物生长的作用进行了论证，结果表明，优质微生物肥料具有固N能力强、活化磷与钾、刺激作物生长、抑制病害等特点，表现出明显的经济效益和社会生态效益^[5]。

目前国内外对放线菌肥料，尤其在液体发酵方面研究报道较少。由于生物肥料的大面积使用，原来土法生产工艺已满足不了现代农业生产的需要，目前已由过去的土法生产发展到应用种子罐、发酵罐的工业发酵法生产^[1]。

本文对链霉菌菌株OO5发酵培养基采用L₉（3⁴）正交试验进行了初步筛选和优化，并研究了通气量对菌体生长的影响。菌液在小麦和玉米上的盆栽试验证明该菌株能够促进农作物的生长，认为该菌具有工业应用前景。

1　材料与方法

1.1　菌种

链霉菌005由河北省科学院微生物研究所提供。

1.2　摇瓶发酵培养基：

1.蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，氯化钠0.5%，pH 7.2～7.4。

2.蔗糖1.5%，淀粉5%，豆饼粉1.7%，K₂HPO₄· 3H₂O0.4%，酵母膏0.3%，（NH₄）₂SO₄0.2%，CaCO₃ 0.2%，NaCl0.2%，pH7.2～7.4。

3.玉米粉2.0%，淀粉2.0%，蔗糖2.0%，豆饼粉1.5%，酵母粉0.1%，（NH₄）₂SO₄ 0.25%，Mg-SO₄ 0.0025%，K₂HPO₄0.02%，NaCl 0.5%，CaCO₃0.5%，pH 7.2～7.4。

4. A4.5% ，B2.5% ，C3.0% ，D0.8%，ZnSO₄0.01% ，KH₂PO₄ 0.001% ，pH 7.0。

5.可溶性淀粉2%，KNO₃0.1%，K₂HPO₄0.05%，MgSO₄0.05%，FeSO₄0.001%，NaCl0.05%，pH 7.2～7.4。

1.3　发酵培养条件

1000ml三角瓶装培养基200ml，接种量7%，28℃振荡培养120小时，转速210r/min。

1.4　发酵培养基正交试验

以4号培养基为基础采用L₉ （3⁴）正交表设计试验，每个处理设2次重复，试验方案见表1。培养基其他组分： ZnSO₄0.01%，KH₂PO₄ 0.001%，pH 7.0。

表1　培养基L₉（3⁴）正交试验因素水平表

1.5　装液量对菌体量的影响

在1000ml三角瓶内分别装100ml、150ml、250ml、350ml培养基。接种量7%，28℃培养120小时，8000r/min离心10分钟收集菌体，蒸馏水洗涤3次，105℃烘干，测定菌体干重。绘制菌体产量随装液量变化曲线。

1.6　小麦和玉米盆栽试验

1.6.1　小麦水培试验

在平皿内放入湿滤纸，按每亩施用0、100、200、300、400ml菌液折算每皿用量，“反交108”种子20粒拌种后放于滤纸上，定期浇水，保持湿润，培养13天。

1.6.2　小麦土培试验

在长10cm，宽10cm，高6cm塑料盆内装入拌匀的沙壤土350g，按每亩施用0、100、200、300、400ml菌液折算每盆使用量基施，每盆内放入小麦“反交108”种子20粒，再覆土80g。相同条件下培养30天。

1.6.3　玉米培养试验

在大试管内装入等量蛭石，加入培养液40ml，再加入玉米“农大215”种子，按每亩施用0、100、200、300、400ml菌液计算每管用量，每个处理做6次重复。定时浇水，培养21天。

2　结果与分析

2.1　培养基筛选与优化

2.1.1　发酵培养基筛选

经5种基础培养基对比试验，菌体干重分别为： 1号培养基1.40g/l，2号培养基15.12g/l，3号培养基8.71g/l，4号培养基17.67g/l，5号培养基1.66g/l。试验结果表明4号培养基菌体产量最高，2号培养基次之，所以以4号培养基为基础设计L₉（3⁴）正交试验，试验结果和数理统计结果见表2、表3。

表2　培养基正交试验结果及其极差分析

表3　培养基正交试验方差分析

F_0.05=4.26，F_0.01=8.02

通过极差分析和方差分析表明，极差R B>C>A>D，B因素和C因素对菌丝产量有极显著影响，A因素对菌体产量有显著影响，D因素对菌丝产量影响不明显。培养基较优组合为： A4.5%，B0.5%，C4.5%，D 0.2%，ZnSO₄0.01%，KH₂PO₄ 0.001%，pH 7.0。

2.1.2　装液量对菌体生长的影响

在1000ml三角瓶内装入100ml、150ml、250ml、350ml培养基，7%接种量振荡培养5天（28℃，210r/min） 。装液量100 ml摇瓶菌体干重为41.1g/l，装液量150 ml摇瓶菌体干重为48.3 g/l，装液量250 ml摇瓶菌体干重为33.5 g/l，装液量350 ml摇瓶菌体干重为23.3 g/l。试验结果证明随通气量增大，菌体产量逐渐增大，当达到一定通气量时菌丝产量不再增加，而是有所下降，最适装量为1000ml三角瓶装150ml培养基，结果见图1。

图1　装液量对菌体产量影响曲线

2.2　小麦、玉米盆栽试验

2.2.1　对小麦出苗时间的影响

按每亩分别施用100ml、200ml、300ml、400ml计算每盆用量，以不施菌剂作对照。小麦种子经24小时催芽。 3天后处理1为98.5%，处理2为92.5%，处理3为89.0%，处理4为87.5%，对照出苗率80%。整体看出苗时间要比对照少半天左右。

2.2.2　小麦水培试验

按100ml/亩、200ml/亩、300ml/亩、400 ml/亩用量的菌剂施用于水培小麦，培养13天，测量株高，结果见表4。试验结果表明不同用量的处理与对照相比，对株高都有显著的促进作用。其中200ml/亩的处理与对照有显著差异，平均株高增加5.7%。 300ml/亩、400 ml/亩的处理与对照有极显著差异，平均株高增加8.7%。对小麦干重影响不显著（数据未显示） 。

2.2.3　小麦土培试验

小麦盆栽试验结果（见表4）表明4个处理的株高与对照相比都有极显著差异，分别增加5.8%、6.6%、6.6%和7.5%。小麦干重没有显著影响（数据未显示） 。

表4　不同菌剂量对小麦株高的影响

*表示差异显著**表示差异极显著

2.3.4　对玉米的影响

分别按每亩施用100、200、300、400ml菌剂计算使用量，以不加菌剂做对照，培养21天，试验结果见表5。试验结果表明不同用量菌剂的处理都明显促进株高生长，与对照都达到极显著差异。对玉米根数也有促进作用。同时玉米叶面积、根重和地上部分干重增加。

表5　不同菌剂量对玉米的影响

**表示差异极显著

3　小结

通过正交试验初步确定了链霉菌JW005的发酵培养基为： A4.5%，B0.5%，C 4.5%，D 0.2%，ZnSO₄ 0.01%，KH₂PO₄ 0.001%，pH 7.0。装液量量对菌体产量有很大影响，最适装量为1000ml三角瓶装150ml。按优化后的培养条件菌体产量接近初始条件菌体产量的3倍。盆栽实验表明链霉菌005对小麦和玉米都有一定促生作用，但玉米的促生作用较小麦明显。证明链霉菌005具有作为微生物肥料工业生产用菌的潜力，将通过不同作物小区实验进一步验证该菌的促生能力。

参考文献：

[1]葛诚.微生物肥料的生产应用及其发展——1995年全国微生物肥料专业会议论文集.北京：中国农业科技出版社，1996

[2]王素英，陶光灿，谢光辉，等.我国微生物肥料的应用研究进展.中国农业大学学报，2003，8 （1） :14～18

[3]朱昌雄，李俊，沈德龙，等.我国生物肥料标准研究进展及建议.磷肥与复肥，2005，20 （4）:5～7

[4]连宾，袁生，臧金平.我国微生物肥料发展的现状与建议.生物加工过程，2004，2 （1）:4～6

[5]许前欣，孟兆芳，于彩虹.微生物肥料农业应用的效益评价.天津农业科学，2000，6 （2）:44～46