响应面法优化褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素的研究

响应面法优化褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素的研究

徐广宇　骆健美　杨德山　王敏⁽¹⁾

（天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室　天津　300222）

摘要：本文采用响应面法即Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验、中心旋转组合实验相结合，对褐黄孢链霉菌种子培养条件进行了优化。结果表明，蛋白胨、NaCl、培养基的初始pH、装液量是影响褐黄孢链霉菌生长的重要因素。优化后得到的培养条件为培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨5.2g/L，NaCl 10.7g/L，酵母粉5g/L，玉米浆10g/L；初始pH 7.7；装液量40ml；接种量15%。此条件下，纳他霉素的产量提高了181.6%，达到2.27 g/L。

关键词：褐黄孢链霉菌；纳他霉素；响应面法；优化

纳他霉素是一种抗真菌剂^[1]，在食品和医疗领域前景广阔。纳他霉素主要由纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis） 、恰塔努加链霉菌（Streptomyces chatanoogensis） 、褐黄孢链霉菌（streptomyces gilvosporeus）发酵而成。目前，纳他霉素产量国外专利水平达到8 g/L^[2]，国内相关报道很少，可见纳他霉素产量提高的空间还很大。国内关于褐黄孢链霉菌发酵生产的纳他霉素的研究集中在发酵阶段，而种子培养条件缺乏系统的研究，但实验表明，褐黄孢链霉菌生长的好坏直接影响到纳他霉素产量。所以，本研究响应面法对影响褐黄孢链霉菌种子培养条件的众多因素进行考察和评价^[3,4]，该方法与传统的单因素和正交实验相比，充分考虑了因素之间的相互作用，并通过模型的建立，具有一定的预测性，拟确定最优的培养条件，为进一步提高纳他霉素的产量奠定基础。

1　材料与方法

1.1　菌种

褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）SG-2002，实验室保藏菌种

1.2　培养基^[5]

1.3　摇瓶培养条件

1.3.1　种子培养在已制备好的甘油管中吸取适量孢子悬浮液于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，29℃，200r/min回转式摇床振荡培养至快速生长期。

1.3.2　发酵培养将摇瓶种子培养液以2%的接种量转接到装液量为50ml的500ml三角瓶中，29℃、200r/min回转式摇床发酵96h。

1.4　实验方法

1.4.1　纳他霉素产量测定高效液相色谱法^[6]。

1.4.2　菌体干重测定准确量取10ml发酵液，6000r／min离心10min，收集沉淀，用无菌水清洗两次后，在100℃烘箱中干燥至恒重，称量并计算菌体干重。

2　结果与讨论

2.1　Plackett-Burman试验设计法筛选重要因素

Plackett-Burman试验（PB）是一种两水平的试验设计方法，它试图用最少的试验次数使因素的主效应得到尽可能精确的估计，从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素。本实验根据前期的单因素实验以及褐黄孢链霉菌的发酵一般规律，初步确定8个因素以及它们的取值范围。实验中选用N=12的Plackett-Burman实验设计^[7]，3个为虚拟变量用于估计误差。实验中PB实验结果见表1，各因素水平的选择及影响效果见表2。

表1　PB试验设计及结果

表2　各因素水平选择及影响效果

如表2可见，显著因素分别是：蛋白胨，装液量，NaCl，初始pH。通过逐步回归分析，得到该菌发酵生产纳他霉素的多元一次回归方程为：

式中，Ynata 为纳他霉素的预测值。从表1 中可知，预测值与实际值最大相对偏差小于8%，并且模型的复相关系数R2=0.973003，说明模型可靠。

2.2　最陡爬坡实验

根据式2-1中回归系数的符号和大小，结合实验的实际需要，在最陡爬坡实验中对纳他霉素产量的显著因素的变化方向、步长作了相应的设计，具体取值和实验结果见表3。而其他因素的取值则根据正效应的因素取较高值，负效应的因素取较低值的原则。

表3　最陡爬坡实验设计及结果

由表3知，纳他霉素产量在0到0+1△之间有一个明显的上升，之后开始下降，最优发酵条件在0+1△和0+2△之间，故以0+1△条件为后续实验的中心点。

2.3　中心旋转组合实验建立多元二次模型方程及其检验

本实验采用中心旋转组合设计展开进一步优化。实验中设计变量及水平取值见表4，实验结果见表5。

表4　中心组合设计中变量及水平取值

表5　中心旋转组合设计及结果

以纳他霉素的效价为响应值，经拟合得到的全变量二次方程为： Y1=1.623333 -0.095833*Xa -0.115833*Xb -0.0975*Xc -0.099167*Xd + 0.247083*Xa*Xa -0.42*Xa*Xb+ 0.39*Xa*Xc + 0.3325*Xa*Xd -0.367917*Xb*Xb -0.4025*Xb*Xc -0.31*Xb*Xd -0.127917*Xc*Xc + 0.75*Xc*Xd -0.082917*Xd*Xd （式2-2）

其中回归方程的相关系数R²=0.9459，说明回归的拟合度较好。

由表6可知，回归模型的F-检验非常显著，说明拟合的二次方程合适。回归模型中的平方项和交互项F-检验显著，说明4个因素影响显著。对回归方程的各项方差的进一步检验可以看出，方程的失拟项很小，因此可以用该方程代替真实试验点对试验结果进行分析。

表6　方差分析表

通过对实验结果的等高线和响应面图分析可知，回归模型存在最大值，此时，四个显著因素的取值为：蛋白胨5.2g/L、NaCl 10.7g/L、pH 7.7、装液量40ml，在此条件下，纳他霉素产量应达到2.37 g/L。按照该结果进行验证实验，纳他霉素产量为2.27 g/L，该结果与预测模型基本一致，说明所得模型具有一定指导意义。

3　结论

本文根据前期的单因素实验和褐黄孢链霉菌发酵的一般规律，采用PB实验从影响纳他霉素合成的8个因素，即葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、玉米浆、NaCl、初始pH、接种量、装液量筛选出4个显著因素，分别为：蛋白胨、NaCl、初始pH、装液量。然后利用最陡爬坡实验对显著因素的最优取值进行了逼近。接着利用中心旋转组合实验对种子培养过程进行了模型拟合，该模型有最大值，在葡萄糖15g/L，蛋白胨5.2g/L，酵母粉10g/L，玉米浆10g/L，NaCl 10.7g/L，pH 7.7，接种量10%，装液量40ml条件下纳他霉素产量达到2.27 g/L。实验证明，理论值与实验值吻合较好，纳他霉素产量比优化前提高了181.6%。

参考文献：

[1]尤新主编.功能性发酵制品[M].北京：中国轻工业出版社，2000

[2] Eiaemehink，Michael Allen.Fermentation process for producing nalamyeinwith additional carbon and nitrogen[P].USAPatent 262804，l994.6

[3]褚以文.微生物培养基优化方法及其OPTI优化软件[J]国外医药抗生素分册，1999，20 （2） :58～61

[4]刘忠，杨文博，孙丹，等.酶法生产L-半胱氨酸培养基的响应面分析优化.南开大学学报，2004

[5]杨东靖，陈冠群，王敏，杜连祥.纳他霉素高产菌株的链霉素抗性选育及其发酵工艺的优化.药物生物技术，2003，10 （2） :84～87

[6]陈冠群，杨东靖，杜连祥.反相高效液相色谱法测定发酵液中的纳他霉素[J].天津轻工业学院学报，2003，18 （1）:9～11

[7]欧宏宇，贾士儒. SAS软件在微生物培养条件优化中的应用.天津轻工业学院学报，2001，1： 14～17

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[9]易丹辉编著. statistica 6.0应用指南.北京:中国统计出版社，2002

【注释】

(1)通讯作者： Email： wangmintj@ahoo.com.cn