高耐性酿酒酵母的杂交选育

高耐性酿酒酵母的杂交选育

吴　帅　肖冬光

（天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：通过耐性试验，比较酵母耐酒精性和耐渗性之间的关系，发现二者并没有必然的相关性，这一结论为菌株的杂交育种提供了理论依据。试验中首先筛选出耐渗性较好的M1和耐酒精性较好的AY-15。分别制备酿酒酵母单倍体，进行生孢培养和孢子分离试验，得到185株产酒、153株耐渗单倍体，经筛选后得到13株产酒性能良好的单倍体和19株耐渗性能良好的单倍体。利用酒精发酵试验进行复筛，得到两株性能优良的单倍体，作为杂交试验的亲本。进行杂交试验，得到236株杂交株，经过耐渗、耐酒精杜氏管试验和发酵性能测定后，得到一株能够在高渗环境中仍然保持较高产酒能力的酿酒酵母，在含盐5%的培养基中发酵产酒精能力分别比AY-15、M1提高19.6%和15.4%。研究表明，杂交育种能够将不同亲株的优良特性结合在一起。

关键词：酿酒酵母；杂交；耐性；酒精产量；浓醪发酵

石油是目前维系世界经济与发展的能源必需品，但其储备非常有限。开发一种新型替代产品，已经成为世界各国能源研究的主要问题。酒精作为能源替代品，与石油相比具有可再生，污染小，可减少温室效应等优点，是世界公认的可再生环保新能源之一。浓醪酒精发酵能够提高设备利用率，降低生产成本，而且酒糟易处理，是一种具有巨大应用价值的酒精生产技术。

酒精生产过程中，由于酒精度的提高可以降低蒸馏时的能耗，发酵时应尽可能地提高成熟醪的酒精度，而酒精含量对酵母菌的生长影响很大，普通酵母在乙醇浓度达11%左右时，发酵完全受到抑制^[1]，所以浓醪发酵时，有必要选用酒精耐性高的酵母菌。另一方面，糖质、淀粉质原料发酵后酒精废糟液中水的含量最多，大多数综合利用的工艺中都包含有将一部分废液返回生产中用于拌料的回用路线。在节约生产用水的同时，废液中残存的某些营养物质可被酵母所利用。酒精废糟中还含有大量对酵母菌的生长和发酵有抑制作用的物质，如无机盐等，随着回用次数的增加，发酵液的渗透压会因为这些物质的多次积累有所增高^[2]，也会影响酵母的生长和繁殖，这也需要菌株具有较好的耐渗性。总之，提高酵母菌的耐酒精和耐渗能力，可以更好地适合浓醪酒精发酵的要求，能够为酒精发酵工业带来显著的经济效益。

本文通过比较菌株的耐酒精和耐渗能力，对实验室现有保藏菌种进行筛选，以得到耐性优良的酿酒酵母菌株。同时对酵母耐性的相关性进行分析，为菌种选育提供理论依据。在此基础上运用杂交育种手段对酵母菌进行改造。本试验中选用的两亲株分别具备高耐渗性和耐酒精的特性，杂交后筛选，获得了在高渗条件下发酵性能良好的酿酒酵母。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　原料

大麦芽、玉米粉。

1.1.2　菌株

Y-1、Y-2、AY-12、AY-15、M-1、M-2、M-3、TY-5、CYK本实验室保存菌种。

1.2　培养基

1.2.1　麦汁培养基^[3]

1.2.2　种子培养基

糖浓度10%玉米水解液，酵母粉5g/L。

1.2.3　发酵培养基

（1）产酒试验：玉米水解液，3g/L酵母粉，2g/L硫酸铵，发酵过程中补加10%的葡萄糖。

（2）耐渗试验：玉米水解液，1.5g/L酵母粉，1g/L硫酸铵。

1.3　实验方法

1.3.1　耐酒精杜氏管试验

将上述九株酵母分别活化后，接入麦汁中，30℃静置培养32h，制得种子培养液。取装有麦汁的试管（内装杜氏管） ，在无菌条件下分别加入不同量的无水乙醇，使培养基中乙醇含量分别为12%、14%、16%、18%、20%，混匀后，种子培养液分别以10%的接种量接入试管中。30℃恒温静置培养，观察产气情况。

1.3.2　耐渗杜氏管试验

种子培养液制备方法同上。选取8%、10%、11%、12%、13%、14%六个NaCl浓度梯度，配制不同盐含量的麦汁培养基，分装入试管（内装杜氏管）中，0.1Mpa灭菌15min。种子培养液分别以10%的接种量接入试管中。30℃静置培养，观察产气情况。

1.3.3　单倍体的制备^[4]

将酿酒酵母AY-15、M-1分别于YEPD液体培养基中28℃培养48h，离心洗涤，弃上清，将酵母泥接种于微量元素培养基平板上，25℃培养5天，在显微镜下可以观察到有子囊孢子形成，收集平板培养基上的菌体。制备菌悬液（10⁶） ，用2%的蜗牛酶30℃水浴处理60min，然后50℃水浴振荡处理10min，杀死二倍体营养细胞，将粘连的孢子打散后涂布YEPD培养基平板，挑取小菌落点接在生孢培养基上，25℃培养6天后镜检，不生孢子者为单倍体，将单倍体分别挑至斜面，统一编号，4℃保存。

1.3.4　单倍体接合型的鉴定

将获得的单倍体菌株分别与标准a型、α型菌株混合培养，与a型菌株形成哑铃形接合子的待测菌株为α型，与标准α型菌株接合的待测菌株为a型，与a型、α型菌株均不接合的为不育型菌株。

1.3.5　单倍体菌株的筛选

取装有麦汁的试管（内装杜氏管） ，加入无水乙醇，使麦汁中酒精含量16%，混匀。将AY-15的单倍体菌株分别接入麦汁中，30℃培养，由产气情况判断酵母的耐酒精性，选出耐性好的菌株。然后利用TTC平板进行复筛。菌株点接到TTC平板下层培养基上，30℃培养2～3d，待菌落长大后，倒入TTC上层培养基，覆盖原有的菌落，之后在30℃下避光培养2～3h，由菌落呈色的深浅判断酵母的产酒精能力，颜色较深的菌落为产酒精性能好的菌株。将M-1的单倍体菌株分别接种到装有麦汁的试管中（内装杜氏管，NaCl含量为13%） ，30℃培养，以亲本菌株做对照，产气速度快、产气量多的酵母为耐渗性好的菌株。

1.3.6　单倍体菌株发酵性能的筛选

菌株活化后，进行种子培养，然后接入发酵培养基，发酵一段时间后补加10%葡萄糖。30℃静置培养，每隔24h测CO₂失重。发酵结束后测定发酵液的酒精度和残糖含量。根据产酒精能力选出发酵性能优良的单倍体菌株。

1.3.7　单倍体杂交及杂交株的检出^[4]

将a型与α型单倍体菌株混合接种于YEPD液体培养基中，30℃摇床培养，观察接合子的形成情况，培养20h后收集菌体，铺YEPD平板，挑取较大的单菌落，在微量元素培养基上鉴定菌株的产孢能力，能够产孢的菌株为二倍体杂交株，编号保存。

1.3.8　杂交菌株的筛选

利用耐酒精和耐渗杜氏管试验对杂交菌株进行筛选。首先将菌株分别接入含有酒精的麦汁中，30℃恒温培养，由产气情况判断酵母的耐酒精性，选出耐酒精性良好的菌株。将选出的菌株接入含有氯化钠的麦汁中，30℃培养，根据菌株的产气情况判断其耐渗性，选出耐渗性能较好的菌株。

1.3.9　杂交菌株发酵性能检测

筛选得到的菌株活化后，进行种子培养，转入耐盐发酵培养基，30℃静置培养，每隔24h测CO₂失重，用CO₂失重来衡量酵母的发酵速度。发酵结束后测定发酵液的酒精度和残糖含量，比较不同菌株的产酒精能力，选出在高渗条件下发酵性能优良的酵母菌株。

1.4　分析方法

1.4.1　酒精度的测定

蒸馏法测定。取100ml成熟发酵液到蒸馏瓶中，加入100ml水，混匀后蒸馏。取馏出液100ml。用酒精比重计测定馏出液中的酒精浓度。

1.4.2　残糖的测定

采用斐林试剂滴定法^[5]测定。

2　结果与讨论

2.1　耐酒精试验

浓醪发酵时，高浓度底物相应地也会生成较高浓度的酒精，过高的酒精浓度对酵母有毒性，会抑制细胞的生长及发酵活性。所以，酵母的发酵能力在很大程度上取决于它们自身酒精耐受力的大小。在评价酵母的酒精耐性试验中，最广泛使用的方法是比较细胞在外加酒精的培养基中生长时受到的抑制程度。本试验通过杜氏管发酵，比较酵母菌在含酒精培养基中的产气速度和产气量的多少，对不同酵母菌株的酒精耐性进行分析，结果如表1所示。

表1　不同酒精度下各菌株的产气情况

注：“+”表示发酵，“-”表示不发酵，“+”的多少表示不同的产气量，“++++”表示气泡满管。

由表1可知，高酒精度对酵母的生长繁殖有延滞作用。Y-1、Y-2、AY-15、M2均能耐到酒精度18%。Y-1、Y-2在16%试管中发酵24h后气体满管，AY-12、AY-15产生的气体未满管，说明Y-1、Y-2比AY-12、AY-15耐酒精能力强。对比16%、18%试管的发酵情况，可以看出，Y-1比Y-2更耐高浓度的酒精。菌株AY-12耐酒精能力较差，在酒精度大于18%培养基中不再生长。 TY-5在酒精含量为12%的麦汁中发酵到12hr时，仅有少量气体产生，其余酒精浓度下酵母生长被抑制没有气体产生； CYK一直无气体产生（表中未注明） 。由以上结果可以判定TY-5、CYK、AY-12三株酵母的耐酒精能力最差。

2.2　耐渗试验

发酵醪液的渗透压较高，引起细胞内水分活度、细胞质组成^[6]发生显著变化，酵母的细胞膜和菌体内的酶受到破坏，从而抑制酵母的生长和发酵。本试验以NaCl作为渗透压调节剂，采用杜氏管试验，根据气体的产生快慢和产气量的多少，比较不同酵母菌株的耐盐能力，如表2所示。

表2　不同NaCl浓度下各菌株的产气情况

注：“+”表示发酵，“-”表示不发酵，“+”的多少表示不同的产气量，“++++”表示气泡满管。

由表2可以看出，当麦汁中NaCl含量在11%以下时，Y-1、Y-2、AY-12、AY-15、M-1、M-2、M-3发酵24h后产生满管气体；麦汁中NaCl含量超过12%时，才能明显看出各菌株耐盐能力的差异。盐浓度为13%的麦汁发酵48h后，Y-2产气量最大，说明此菌株的耐渗能力较好。本试验中，Y-1、Y-2、M-1、M-2的最高耐盐度为14%，AY-12、AY-15 、M-3可耐13%的盐度，AY-12耐渗能力略高于AY-15。TY-5、CYK产气速度较慢，在盐浓度高于11%的麦汁中均不发酵，这说明TY-5、CYK两株酵母的耐渗性最差。

2.3　单倍体的制备、接合型鉴定及菌株的筛选

制备酿酒酵母AY-15、M-1的单倍体，经过产孢培养基鉴定分离后，分别得到185、153株单倍体菌株。鉴定单倍体的接合型，结果表明，a型所占比例约为1/4，α型约占1/2，不确定株约占1/4，这可能与二倍体带有隐性致死基因或带有能使孢子不育的遗传因子有关^[7]。菌株AY-15是一株产酒性能优良的酵母，所以在其单倍体筛选时对其耐酒精、产酒精性能进行比较。酵母菌进行酒精发酵的主要途径包括葡萄糖酵解和丙酮酸的无氧降解，在此过程中糖-酒精转化酶起主要作用，TTC （2，3，5-氯化三苯基四氮唑）能对酵母的代谢产物产生呈色反应，通过它可以判断酵母中转化酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低^[8，9]。将在一定的培养基上培养的酵母菌落上覆盖一层TTC显色剂，TTC会显不同的颜色，产酒精能力强的酵母会显现深红色，依照此原理筛选出产酒能力强的单倍体。经过两次筛选后共得到13株优良的单倍体菌株。菌株M1是一株耐渗性能优良的酵母，其单倍体根据耐渗性的差异进行筛选。耐渗杜氏管试验中，约有20%的单倍体在高渗培养基中的发酵情况好于二倍体。最终选出19株耐渗性较好的单倍体。

2.4　单倍体菌株发酵性能筛选

分别对AY-15、M-1的单倍体菌株进行发酵性能测定。比较单倍体的菌株发酵能力，结果发现：由同一株二倍体得到的单倍体之间产酒能力差别很大，这表明酿酒酵母的发酵能力由多个基因控制。AY-15的绝大多数单倍体菌株产酒量大于二倍体。根据发酵速度（数据略）和产酒量（表3）选取A5作为杂交试验的亲本。M1的单倍体菌株产酒精能力参差不齐（表4） ，差别较大，选择M1-2作为杂交亲本。本试验分两次进行，由于两批试验醪液初始糖度及试验条件不同，两组数据之间不能进行比较。

表3　AY-15单倍体菌株的酒精度（%，v/v）

表4　M1单倍体菌株的酒精度（%，v/v）

2.5　杂交菌株的检出及杂交株的筛选

将来源于不同亲本的单倍体A5 （MATa）和M1-2 （MATα）进行杂交试验，挑选出具有产孢能力的杂交株共236株。首先，比较各菌株在耐渗平板上菌落的生长情况，选出生长速度较快和菌落较大的菌株，然后进行耐渗杜氏管试验。经过两次耐渗筛选后得到98株单倍体。在试验中发现，许多杂交株明显比亲本更耐高渗，试验中氯化钠浓度为14%，高于单倍体筛选时的氯化钠含量。将98株菌株进行耐酒精试验，比较杂交株和亲本的耐酒精能力，结果发现，约76%的杂交株耐酒精性高于亲本，15%的杂交株耐酒精性与亲本相差不大，仅有9%的杂交株耐性略低于亲本（数据略） ，部分菌株可耐21%的酒精度。选出34株耐酒精性最好的杂交株进行发酵试验。试验结果中耐性的差异表明，在营养体的单倍体化与单倍体杂交过程中，与耐性相关的基因通过分离、移动和重排进行了重新分布，导致不同杂交株的耐酒精和耐渗性能有差异。绝大多数菌株耐酒精性较好，可能是因为与耐性相关的基因经过杂交后在新的菌株中重新分布，并在菌株的发酵性能方面得到了很好的体现。

2.6　杂交菌株发酵性能筛选

将得到的34株杂交株和原始亲株进行发酵性能试验，产酒量高于出发菌8%以上的杂交株见表5。比较菌株的产酒量和残糖含量两项指标，结果显示，菌株AM-5在高渗透压条件下的产酒能力最强，产酒量为8.25 （%，v/v） ，分别比亲株AY-15、M1提高了19.6%和15.4%，这表明杂交二倍体菌株AM-5既获得了亲株AY-15的高产酒量的性状，又获得了M1的耐高渗性状，杂交菌株在高渗玉米液中发酵表现出了较高的发酵能力。

表5　杂交株的发酵性能

单位：酒精度%，v/v；残糖g/100ml。

3　结论

3.1　本试验通过杜氏管耐性试验，对酵母的耐酒精性和耐渗性进行比较，分析酵母菌两种耐性之间的关系，结果表明二者没有必然的相关性，这为菌株的选育提供了理论依据。

3.2　试验中筛选出耐渗性较好的M1和耐酒精性较好的AY-15，制备单倍体，并进行杂交试验，共得到200多株杂交株。对杂交株的耐性筛选发现，与亲本相比，部分杂交株的耐酒精性和耐渗性显著提高。菌株在含盐5%的培养基中的发酵，筛选得到一株在高渗条件下发酵性能优良的杂交株AM-5，产酒量为8.25 （%，v/v） ，分别比亲株AY-15、M1提高了19.6%和15.4%。

3.3　杂交育种可以通过基因的分离、移动和重排进行重新分布，有可能改善酿酒酵母的发酵特性。本试验中，杂交株的产酒能力和耐渗性均比亲株有所提高，通过此方法可以达到合并工业菌株特性的目的。

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