黑腹果蝇基因组中的因子

现在知道麦克林托克在玉米中发现的转座因子Ac是DNA转座子（DNA transposon）。第一个在分子水平得到阐明的DNA转座子是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的P因子（P elements）。

果蝇P因子的发现源自一次意外的杂交不育实验。当人们将实验室最常用的黑腹果蝇株系的雌蝇与野外采集的黑腹果蝇株系的雄蝇做杂交试验，发现由此产生的子代果蝇竟然是不育的。而相反的杂交，即野外采集株系的雌蝇与实验室常用的果蝇株系的雄蝇杂交产生的子代果蝇却是正常可育的。那么，这种杂交不育（hybrid dysgenesis）究竟是基因突变还是染色体畸变引起的呢？我们把杂交中实验室常用的果蝇株系的细胞类型称为M型，把野外采集株系果蝇的细胞类型称为P型。实验中M型雌蝇与p型雄蝇杂交产生的子蝇的生殖系细胞出现了高频率基因突变和染色体畸变，以及染色体不分离等异常现象而不能生育，成为有生物学缺陷的不育果蝇。有趣的是相反的杂交，即p型雌蝇与M型雄蝇杂交产生的子蝇是正常可育的。

图7-20　黑腹果蝇的P因子导致不育现象的可能原因（引自A.J.Griffiths）

值得注意的是大多数果蝇的不育性状是不稳定的，会以很高的频率回复成野生型或变为其他等位基因的突变，这种不稳定性往往限于M型果蝇的生殖系细胞。这种现象和玉米中转座因子插入突变的高回复率极为相似。于是有学者提出了一种假设，认为果蝇的这类杂交不育可能是转座因子插入特定基因致使其失去功能所造成的，那么，这种突变的回复就应该是插入序列被切除的结果。这个假设在果蝇不稳定的白眼突变（white，w）株的成功分离中得到了验证。实验分析证实这个突变株的绝大部分突变果蝇是由于一个称为P因子的转座因子插入了野生型等位基因wv而造成的，而M型果蝇株则完全没有P因子。分析还表明在P型果蝇株的每个基因组中存在着30～50个P因子拷贝，P因子长度因中间部分存在不同程度的缺失而不同，它的变化范围从0.5～2.9 kb。现已测得黑腹果蝇完整的P因子长度为2 907 bp，含4个外显子和3个内含子，两侧装有31 bp反向重复序列（图7-21）。图中显示了P因子的4个外显子ORF0、ORF 1、ORF2和ORF3，以及3个内含子，两侧的红色三角形为反向重复序列。在体细胞中前3个外显子剪接在一起表达，经翻译后生成分子量为66 000的抑制蛋白能抑制所有P因子的转座活性。在生殖系细胞中4个外显子都剪接在一起表达，经翻译后生成分子量为87 000的转座酶，使P因子得以在M型细胞中转座。不育和其他遗传损伤就是基因组中的P因子和分子量为66 000的抑制蛋白在M型细胞中相互作用的后果。

图7-21　果蝇P因子的结构及其在体细胞和生殖系细胞中的差异性转录、翻译与遗传学效应（改自A.J.Griffiths等）

对于杂交不育的解释的假设是，野外采集株果蝇的基因组中除了存在P因子外还有一种抑制P因子转座的抑制蛋白。按照这个模型，P因子不但编码负责自身转座的转座酶，也编码阻遏转座酶合成的抑制蛋白。出于某种未知的原因，实验室株果蝇不含有P因子，所以细胞质中不存在P因子编码的抑制蛋白。当不含P因子的M型雌蝇与携带了P因子的雄蝇交配时，因为精子只提供带P因子的基因组，而不提供含有抑制蛋白的细胞质，来自雄蝇的P因子就处在新形成的没有抑制蛋白的受精卵细胞质中，所以就可以在基因组中进行转座，一旦插入功能性基因引起突变，就可能导致不育等遗传损伤。而P型雌蝇与M型雄蝇杂交时，因由雌蝇提供的细胞质中存在着P因子及其编码的抑制蛋白阻遏了转座的发生，因此不会造成不育。那么，为什么实验室果蝇株不含P因子呢？一个可能的解释是，我们使用的实验室株果蝇是摩尔根等从100年前采集的果蝇样本逐步选育而成的，那个时期的果蝇群体中并不含P因子。然而，在此后的100年中的某个时间，P因子进入了野外的果蝇自然群体。尽管P因子进入果蝇群体的真实情况并不清楚，但研究显示转座子确实能迅速从群体中极少数个体扩散到整个群体，就像携带抗性基因转座子的细菌会将转座子迅速地扩散至原先敏感的细菌群体一样。

P因子插入引起的基因突变还可以用于基因定位的标记工具。P因子的插入会使被插入的基因断裂而丧失功能，并产生异常的表型。如果将P因子的部分DNA序列做成探针，通过分子杂交就能找到断裂的基因，还可以进一步克隆这个基因，这种实验方法称为转座子标记法（transposon tagging）。鲁宾（G.Rubin）和斯波拉廷（A.Sprading）还将P因子用作果蝇的转基因实验工具，开创了果蝇的逆向遗传学（reversegenetics）研究。传统的经典遗传学主要借助自发突变或诱发突变产生的表型变异来定位基因、研究基因的结构和功能、克隆，以及在分子水平上鉴定基因。逆向遗传学则把研究的程序反过来，通过分子生物学技术将突变引入序列已知的基因，再分析突变造成的表型效应，如特定生物学或生物化学反应的阻断，及其引起的异常表型来分析结构与功能的关联。转座因子的插入技术则是逆向遗传学研究的重要工具。现在P因子已经成为果蝇遗传学家最感兴趣也是在基因工程实验中最有应用价值的转座因子。

麦克林托克最初在玉米中发现的Ds-Ac转座系统中的Ac因子两侧也有反向重复序列，并能编码转座酶，所以是能自行独立进行转座的自主型转座子。Ds因子不能编码转座酶而不能自行转座，所以称为非自主型转座子。当基因组中存在Ac因子时，它编码的转座酶能识别并结合于Ac或Ds的两端，以启动转座过程（注意：Ac和Ds同属一个转座子家族，可以相互识别和相互作用，在玉米中还存在多个不同的转座子家族，参见图7-5）。与P因子只能在果蝇基因组中发挥作用不同，Ac作用的范围可以从玉米扩展到模式生物拟南芥和水稻、大麦等农作物的基因组。实际上Ac因子早就成了植物遗传学研究和农作物育种的重要分子工具。

现在看来麦克林托克发现玉米的转座因子也许并不是完全偶然的，研究表明在现今玉米（Zea mays）的总量为2.3gb的基因组中，几乎85%是转座因子。玉米约有40 000个平均长度为3.3 kb的基因，这些基因就像由100万个转座子和逆转座子组成的汪洋大海中的点点孤岛。