花椒素的发现和结构改造

11.2.1 基于α7n ACh Rs的药物筛选模版

11.2.1.1 GTS-21

海洋生物纽虫体内有许多具有毒性的生物碱、肽、蛋白质等物质。Anabaseine结构式如图11-5（a）所示，是第一个从纽虫体内提取出来的生物碱，能够刺激许多种n ACh Rs，是许多种该类受体的激动剂，包括α7n ACh Rs和α4β2n ACh Rs。因为它作用于多种胆碱受体，所以不能够被用作药物。

图11-5 （a）Anabaseine结构式；（b）GTS-21结构式；（c）GTS-21的三维结构

Taiho制药公司的α7n ACh Rs激动剂GTS-21结构式如图11-5（b）所示，又名DMXBA，化学名为3-[（2，4-dimethoxy）benzylidene]-anabaseine，是根据Anabaseine结构人工合成的一种化合物。研究表明，GTS-21对与精神分裂症和阿尔茨海默病相关的记忆和认知活动有明显的改善作用。GTS-21是第一个能够选择性作用于α7n ACh Rs的激动剂，也是第一个进入临床试验用以改善阿尔茨海默病、帕金森病和精神分裂症患者认知障碍的药物。

11.2.1.2 GTS-21与α7n ACh Rs的相互作用

实验表明，GTS-21能够明显地提高阿尔茨海默病患者的认知和记忆能力，是一种非常有效的抗阿尔茨海默病药物，目前正处于三期临床。它能够选择性地刺激α7受体，是α7n ACh Rs的激动剂。在高浓度时，它还是α4β2受体的拮抗剂，当浓度更高时，它又是其他种类n ACh Rs的拮抗剂，但拮抗作用较弱。分子模拟等理论研究表明，GTS-21分子与α7受体结合的活性口袋位于两个α7亚基之间[见图11-6（a）]。对于活性口袋而言，该分子的体积太大[见图11-6（b）]，它与受体结合的能量主要来自范德华相互作用。理论模拟证实，GTS-21及其羟基代谢物与α7受体结合的三维结构非常类似。

图11-6 （a）GTS-21（球棍）与α7二聚体（缎带）复合物的结构；（b）相对于活性口袋，GTS-21有较大的分子体积（彩图见第412页）

与GTS-21一样，GTS-21的羟基代谢物（见图11-7）也是α4β2受体的弱拮抗剂，同时也能够与α7受体相结合。事实上，羟基代谢物对α7受体的作用要强于GTS-21。但由于其极性过大，不能通过血脑屏障，因此在给药后，在α7受体附近的浓度远低于GTS-21，其实际作用效果不如GTS-21。提示在药物筛选过程中，要选择那些极性和分子体积都比较小的化合物，使其能够通过脑膜并与α7n ACh Rs有更好的结合。

11.2.2 基于α7n ACh Rs的药物筛选结果

类似第10章抗HIV病毒药物的筛选，先进行相似性搜索和柔性叠合研究。相似性搜索的目的是为了排除那些与靶标结构不可能匹配的分子，减少进入下一阶段的化合物的数目。本小节以临床试验药物GTS-21为模版在NCI数据库中做相似性搜索。在此之前，首先计算数据库中每个小分子化合物的指纹图谱（finger print），然后进行比对。

相似性搜索后，约从数据库中得到70个小分子，排除体积过大和极性过强的分子，根据Lipinski’s“Ruleof5”去掉不适合成为口服药物的分子后，最终得到18个小分子（结构见附录）。将这些分子分别与GTS-21做柔性叠合，进一步判断它们之间的相似程度，柔性叠合结果如表11-1所示。叠合得分（S）越低，该分子与GTS-21的相似程度越大。叠合能量（U）表示该构象下小分子化合物的能量，这个值可以作为一个参考。

图11-7 GTS-21的体内代谢（有P450参与）过程

代谢途径的相对比例取决于底物浓度。无论体内还是体外，2，4-Di OH-GTS-21的可检测浓度都很低。

表11-1 18个小分子化合物与GTS-21分子的叠合结果

（续表）

注：其中WGX-50和gx-138是从该实验组构建的小数据库中筛选出来的。

11.2.3 基于α7n ACh Rs的分子对接和动力学模拟

当一个分子的对接能量小于GTS-21的对接能量时，该分子具有与受体潜在的较好的结合能力。但这并不意味着，每一个对接能量小于GTS-21的分子都可以成为候选药物。有的小分子对接能量较低，是因为它没有填满受体的活性口袋。这样的小分子虽然对接能量低，但它不能对受体起很好的抑制或激动作用，因而不能成为先导化合物。因此，对于一个分子是否能够与α7受体很好地结合，除了看对接能量外，它与活性口袋周围残基的氢键相互作用、疏水场的匹配等都是相当重要的。大量研究表明，氢键的相互作用在药物与其受体的结合中起到了重要作用。因此，配体与受体之间是否形成氢键以及形成氢键的强弱，是判断两者结合优劣与否的重要标志之一。

通常来讲，药物与受体的相互作用中最重要的有两点：①药物与受体分子中电荷的分布与匹配；②药物与受体分子中各种基团和原子的空间排列和构象互补。药物与受体的互补程度越大，其特异性越高，相互作用越强。同时，互补性随着药物受体复合物的形成进一步增高。氢键相互作用表征了复合体系中各种基团的相互匹配程度；范德华相互作用表征了空间结构的互补；静电作用和疏水作用表征了药物与受体分子中电荷的分布与匹配。

为此，应从对接结果中筛选出那些结合能低于GTS-21的分子，同时还要从这些分子与受体活性口袋残基的相互作用和分子表面示意图中，深入分析所形成的氢键和亲水疏水匹配的具体细节。选择上述3个指标都很好的分子作为药物先导化合物，并做下一步分子动力学模拟。研究结果显示，WGX-50与GTS-21有高度相似性：WGX-50与GTS-21的分子柔性叠合好[见图11-8（a）]，叠合得分低（209.9790，见表11-1）；与GTS-21的氢键和亲水疏水匹配[见图11-8（b）]。综上，花椒素WGX-50与α7受体的结合最好，是潜在的药物先导化合物。WGX-50是从研究人员自己构建的数据库中筛选出来的实体分子，是一种花椒提取物，因此以“花椒素”命名。

图11-8 WGX-50与GTS-21的分子叠合图（a）和药效团显示（b）（彩图见第413页）

从对接结果来看（见表11-2），WGX-50两个力场下的结合能U_binding均小于GTS-21；两个力场下，都形成了强的氢键相互作用——对接形成的氢键数分别为1和4，且WGX-50与受体的静电相互作用能量U_ele均略高于GTS-21，而范德华相互作用能量U_vdw则远低于GTS-21。氢键及静电相互作用数据表明， WGX-50与α7受体的电荷分布与匹配不如GTS-21。范德华相互作用数据表明， WGX-50与α7受体结构的空间的互补性远好于GTS-21。

表11-2 各力场下WGX-50和GTS-21与受体对接的能量比较和分子对接形成的氢键

注：U_ele为静电相互作用能量；U_vdw为范德华相互作用能量；U_ligand为小分子的能量；U_binding=U_ele+U_vdw。在相同力场下，认为U_binding越低对接结果越好。该表中的氢键为分子对接结果中形成的氢键（包括那些有可能是氢键，但软件未将其标识的）。

表11-3 WGX-50和GTS-21的分子式和分子质量

花椒素WGX-50具有与α7受体较好空间互补性的驱动力是什么？WGX-50与GTS-21的分子式、分子量都非常接近（见表11-3），不同之处在于WGX-50比GTS-21多一个O和H，少一个N。这说明两者的分子体积接近。因此，分子大小不是驱动力，从其分子结构来考虑，WGX-50分子的两个芳环通过一个较柔性的结构连接起来，而不像GTS-21那样通过一个环连接（见图11-9）。这样，WGX-50就具有较多的低能构象，且能很好地安排两个芳环在α7受体活性口袋内的位置和取向，从使其具有更好的空间互补性，有更低的范德华相互作用能量。

图11-9 WGX-50与GTS-21的分子结构

目前，氢键键长的定义有两种：①受体原子与H原子之间的距离为键长；②受体原子与给体中与H相连的O或N间距离，即氢键中两个重原子之间的距离为键长。本节采用前一种。同时，对于氢键键长的范围也有多种说法，有人认为在2.0～4.0Å范围内，有人则认为在2.5～3.5Å范围。除键长外，原子在空间的取向是氢键形成的作用因素。

我们分别在MMFF94和CHARMM22力场下，进行了分子动力学模拟研究，以揭示花椒素WGX-50与α7受体活性口袋处周围残基更为细致的氢键相互作用。模拟结果显示（见图11-10），两个力场下花椒素WGX-50与α7受体活性口袋处周围残基间均形成了很好的氢键相互作用，酰胺基团上的H是重要的氢键给体，酰胺基团和两个甲氧基上的O是重要的氢键受体。在MMFF94力场下，氨基H作为氢键给体与TRP_149、TYR_195形成氢键，键长分别为2.71Å和1.51Å；羰基O与SER_150羟基H的距离为3.13Å，有可能形成氢键。在CHARMM22力场下，氨基H作为氢键给体与CYS_191形成氢键，间位甲氧基的O与GLU_193形成氢键，键长分别为2.89Å和3.48Å；此外，羰基O与TRP_149吲哚环上H的距离为2.84Å，且原子的空间取向合理，有可能形成氢键。

模拟研究还表明，花椒素WGX-50分子具有较高的柔性，尤其是两个芳环间的柔性链，它在活性构象中折叠成与环相似的结构。另外，MMFF94和CHARMM22力场下该分子的亲水疏水性拟合的相当好，芳环位于疏水区，中间的碳链则位于亲水区（见图11-11）。

图11-10 分子动力学模拟在力场MMFF94（a）和CHARMM22（b）下，显示的花椒素WGX-50与α7受体活性口袋周围部分氨基酸残基的氢键（数字表示键长）相互作用（彩图见第413页）

图11-11 分子动力学模拟在力场MMFF94（a）和CHARMM22 （b）下，花椒素WGX-50（球棍模型）与α7受体的复合物的分子表面。蓝色为亲水表面，绿色为疏水表面（彩图见第413页）

至此，通过分子动力学模拟，我们得到了花椒素WGX-50在不同力场下的最低能量构象，同时也得到了它对接的活性构象。对这两个结构，分别在MMFF94和CHARMM22力场下做对比，发现花椒素WGX-50的结构变化不大——变化基本上来源于两个芳环之间的碳链柔性（见图11-12）。这说明α7受体的活性口袋相对配体花椒素WGX-50而言，较为狭小——疏水区的结构较为固定，亲水区的结构有柔性变化。

图11-12 在MMFF94（a）和CHARMM22（b）力场下，WGX-50的MD最小能量构象与对接活性构象的对比（彩图见第414页）

最后，根据分子动力学模拟的结果，我们比较了WGX-50和GTS-21在α7受体活性口袋周围的氨基酸残基（残基中至少有一个重原子与配体中的一个重原子的距离在5Å内）。从表11-4可以看到：①在两个力场下，活性口袋周围的氨基酸残基基本相同，这说明不同力场下的预言结果的一致性。②活性口袋周围的氨基酸残基大多是亲水的，如Ser、Gln、Thr、Lys等。③受体中形成二硫键的Cys190和Cys191参与了活性口袋的形成。④GLU_193A、TRP_149A在两个配体分子与α7受体的氢键相互作用中起到了重要作用。CHARMM22力场下，GLU-193A作为氢键给体与花椒素 WGX-50甲氧基中的O形成氢键。MMFF94和CHARMM22力场下，TRP_149A均与花椒素WGX-50形成氢键。对于GTS-21， TRP_149A和GLU_193A在MMFF94力场下与之形成氢键。此外，TYR_188A、SER_150A、CYS_191A、GLN_117B亦与氢键的相互作用相关。

表11-4 不同力场下WGX-50和GTS-21与α7受体结合的活性口袋的氨基酸残基

（续表）

注：残基后以A/B表明其来源于α7受体的不同氨基酸链。黑体表示参与形成氢键的氨基酸残基，包括那些可能形成氢键但未被软件标识的残基。最后一列数字为分子动力学模拟结果的氢键数。

至此，我们通过相似性搜索、柔性叠合、分子对接、分子动力学模拟等一系列筛选过程，得到了一个与α7受体结合很好的分子，即花椒素WGX-50，它是一个优良的潜在药物先导化合物。

11.2.4 花椒素的结构改造

11.2.4.1 同系物系差方法改造花椒素

同系物间由于烷基数目的不同，脂水分配系数不同、疏水性不同、脂溶性不同。统计数据表明，碳链中每增加一个—CH2—，脂水分配系数增大0.56。以同系物系差方法改造分子，即通过增长或缩短化合物碳链来改变分子结构。如果烷基链用以支撑药效团在空间的取向和位置，那么碳链长度的变换可引起活性强度的变化，甚至活性翻转。如果向分子引入支链烷基（如叔丁基），则可改变分子的立体性，在分子与受体相互作用时引入空间位阻，而且还会改变分子构象。

应用此法，对花椒素WGX-50做结构改造时（见图11-13），把甲氧基取代苯环和酰胺基之间的—CH2—CH2—分别改造成：①—CH2—；②—（CH2）3—；③—（CH2）4—；④—CH（CH3）CH2—；⑤—CH2CH（CH3）—；⑥—C（CH3）═CH—；⑦— ═CH C（CH3）—。

图11-13 采用同系物系差（①～⑦）和电子等排体方法（⑧～12）改造花椒素WGX-50

将依法改造的7个分子与α7受体进行分子对接（见表11-5）。总体来看，除分子3和分子7具有很高的对接能量U_binding之外，其他分子的对接能量从-7.8633～36.1683变化不大。分子1到分子3的对接结果表明，随着碳链的增长（从1个增加到4个），分子对接的范德华相互作用能量U_vdw和配体能量U_ligand均逐渐升高。这是因为随着碳链的增长，分子折叠成活性构象后的体积和能量变大了。分子3的范德华相互作用能量U_vdw远比分子1、分子2和花椒素WGX-50高，提示我们不宜再增长碳链。很显然，花椒素WGX-50有最好的氢键相互作用。可以推断，甲氧基取代苯环和酰胺基之间的碳链支撑了WGX-50药效团的空间位置和取向。当碳链长度为2时，酰氨基和甲氧基都能参与氢键的形成。为此，也不宜改变碳链长度。

表11-5 同系物系差法改造花椒素WGX-50的对接结果和氢键相互作用（CHARMM22力场）

（续表）

注：斜体表示的氢键是软件未标识，但原子距离和取向都比较合理，可能形成氢键。

分子4到分子7的演变，是通过引入甲基侧链来改变花椒素WGX-50的立体性和脂溶性。从结果来看（见表11-5），分子4不仅对接能量U_binding小，而且还有很好的氢键相互作用，共计形成了4个氢键。因此，这个分子的改造是成功的。分子5的范德华能量较高，因而这种改造使分子的空间结构与受体不能很好地匹配。分子6的对接能量U_binding不大，但未形成氢键。分子7的对接能量U_binding非常高，原因可能是取代甲基使苯环不能灵活地调整其在活性口袋的位置和取向。另外，这种分子改造使原本疏水的部分更加疏水，而芳环之间的柔性碳链应是亲水的（见图11-11）。

11.2.4.2 电子等排体方法改造花椒素

经典的电子等排体理论认为，具有相同原子数和价电子的原子或分子是电子等排体，它们具有相同的化学性质。如今，电子等排体的概念已不再局限于经典的理论框架中，转而认为，凡是经相互替换而具有相似或拮抗生物活性的片段结构，即互为电子等排体。CADD对化合物有诸多的特性描述，如大小、形状、疏水性（脂水分配系数）、电性（电子分布和氢键形成能力等）、立体性、构象等。按照广义的生物电子等排体理论，可以任何具有同等特性的原子或基团替换原结构来改造先导化合物，从而提供更多潜在的药物新实体。

将依法改造的5个分子与α7受体进行分子对接。结果如表11-6所示，分子8的对接能量U_binding比花椒素WGX-50低，达到了预期效果，这说明稍微提高苯环亲水性的思路正确。分子9的对接能量U_binding明显上升，这可能与噻吩环中硫原子的电负性不高，且原子半径较大有关。但是分子9与α7受体有很好的氢键相互作用，共计形成了3个氢键。分子10的对接能量U_binding与花椒素WGX-50接近。分子11的范德华相互作用U_vdw增高，这与氨基增大了分子体积有关，这说明不宜在苯环上引入极性基团。分子12的对接结果很好，能量U_binding略低于花椒素WGX-50，且有较好的氢键相互作用。同时，用硫原子替代氧原子后，化合物的亲脂性应有所提高，所以分子12的改造比较成功。总体而言，这种改造方法是比较成功的，对接能量从-14.4734升高到61.4680。分子8、9和12都可以作为候选药物。

表11-6 电子等排体方法改造WGX-50的对接结果和氢键相互作用（CHARMM22力场）

注：斜体表示的氢键是软件未标识，但原子距离和取向都比较合理，可能形成氢键的。

11.2.4.3 几个相似的天然产物

事实上，在药物的筛选过程中，相似性搜索遗漏了3个与花椒素WGX-50结构非常相似的小分子化合物（见图11-14）。为此，我们也做了对接研究，结果表明（见表11-7）：3个分子与α7受体的静电相互作用能量U_ele，比花椒素WGX-50略低。但范德华相互作用能量U_vdw增大，这可能与分子体积有关。它们总的相互作用能量高于花椒素WGX-50，其中gx-180的范德华相互作用能量U_vdw和总的对接能量U_binding都远高于花椒素WGX-50。由于2个羟基是很强的氢键给体/受体，所以gx-180与α7受体有很好的氢键相互作用，共计形成了4个氢键。但考虑到2个羟基的亲水性，gx-180的脂溶性可能不好而不能通过血脑屏障，所以并不是潜在的药物先导化合物。

图11-14 三个相似天然化合物的结构

仅通过一个甲基取代花椒素WGX-50结构中氨基氢而得到gx-51分子，但从对接结果来看，这个变化并未影响对接能量，与WGX-50相比，对接能量U_binding仅相差9.1729。但正是因为甲基的取代，氨基不再是氢键给体或受体。事实上， gx-51只与α7受体有两个氢键相互作用。同时，由于甲基的引入，gx-51的脂溶性可能会强于花椒素WGX-50。此外，gx-51对接的配体能量U_ligand很高，这可能因为甲基的立体性使gx-51的活性构象能量增高。

3个分子中，gx-52的结构与花椒素WGX-50差别最大，但对接能量U_bind-ing略高于花椒素WGX-50，并且与α7受体有很好的氢键相互作用，共计形成5个氢键[见表11-7和图11-15（a）]。此外，与WGX-50在受体活性口袋的药效团分布一样，gx-52芳环位于疏水区，中间的碳链位于亲水区[见图11-15（b）]。因此，可以考虑将gx-52作为药物先导化合物。

表11-7 三个相似天然化合物与α7受体的对接结果和氢键相互作用（CHARMM22力场）

（续表）

注：斜体表示的氢键是软件未标识，但原子距离和取向都比较合理，可能形成氢键。

图11-15 gx-52分子与α7受体的氢键（数字表示键长）相互作用（a）和分子表面疏水性分布（b）（彩图见第414页）

11.2.5 小结

综上所述，花椒素WGX-50结构的改造共产生了5个优良分子，它们分别是分子4、分子8、分子9、分子12和gx-52。从能量的角度来看，分子8和分子12是最成功的。gx-52是除花椒素WGX-50外最好的天然产物。分子4在对接中，形成了非常好的氢键相互作用，几乎与gx-52分子一样完美。氢键键长也比较合理，从各方面看，这种改造最为成功。分子8与α7受体相互作用研究发现，分子8结构中的吡啶环周围兼有亲水和疏水残基，且亲水残基比重较大。很明显，吡啶环与α7受体有更好的静电场匹配。

研究人员进行了文献调研，发现WGX-50和gx-52是从花椒属植物中提取出来的酰胺类化合物，这个分子能够人工合成。花椒收载在《中国药典》（2015版）中。在中药中，花椒用来治疗癫痫。研究证实，癫痫与乙酰胆碱受体（α4）2（β2）3跨膜区的氨基酸突变有关。该受体与α7受体同位于大脑海马区，占中枢神经系统胆碱受体的85%。gx-180是从南五味子中提取出来的天然产物。南五味子被《中国药典》（2015版）收载，功效与神经系统和肾脏有关。

NCI数据库中的分子数十万个，但从中筛选出来的优良配体只有4个，远不如花椒素WGX-50。因此，迫切需要创建一个中药小分子库，以便于小分子药物的筛选与设计。此外，还应创建专门的子数据库，如专门用于神经系统疾病治疗的中药有效成分数据库。这样就能比较充分地利用中药知识，节省药物开发成本，使药物筛选更理性。

以下是花椒素WGX-50的详细信息：

【中文名】N-（3，4-二甲氧基苯乙基）肉桂酰胺；N-（3，4-二甲氧基苯乙基）桂皮酰胺；N-（3，4-二甲氧基苯乙基）桂酰胺；N-（3，4-二甲氧基苯乙基）-3-苯基丙烯酰胺。

【英文名】2-Propenamide，N-[2-（3，4-dimethoxyphenyl）ethyl]-3-phenyl-；（2E）-Synonyms：2-Propenamide；N-[2-（3，4-dimethoxyphenyl）ethyl]-3-phenyl-， （E）-；Cinnamamide，N-（3，4-dimethoxyphenethyl）-，（E）-（8CI）；Lemairamin， （2E）-N-[2-（3，4-dimethoxyphenyl）ethyl]-3-phenylprop-2-enamide。

【性状】本品为白色固体，微有桂皮香气。

【理化性质】熔点为123℃～124℃，难溶于水。20℃时，乙醇中的溶解度为9.5g/100ml，丙酮中的溶解度为3.4g/100ml。Lg P=3.25，p Ka=15.60。

【CAS】29946-61-0。

【分子式】C19H21NO3。

【分子质量】311.37u。

【贮藏】低温，密封。