血管基底膜和崩解

基底膜和ECM主要由两种成分组成，一是结构蛋白，包括胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白和玻璃体结合素等；二是糖氨聚糖，其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）。胶原Ⅳ、层黏连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖三者彼此相互连接。HSPG在质量上仅占基底膜的1%，但在维持基底膜的电负荷和结合生长因子方面起重要作用。基底膜被认为含有50多种以上的物质组成，为细胞因子和血浆蛋白提供锚定位点。血管通透性的增加，使得循环中的一些大分子特别是纤维蛋白原进入周围组织间隙中，并很快凝聚成交叉连接的纤维蛋白；同时，由肿瘤或内皮细胞分泌的纤溶酶原激活物可激活来自血浆的纤维蛋白溶酶原，产生的纤溶酶既可对纤维蛋白凝胶施以调节，也可激活基质中的金属蛋白酶，消化基质中的其他成分。

基底膜和ECM的崩解与多种蛋白酶的作用有关，根据负责催化作用的化学基团的性质，参与ECM重建的蛋白酶可以分为四大家族：丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶家族中纤溶酶原系统研究较为透彻。纤溶酶原系统包括：①纤溶酶原；②尿激酶和组织型纤溶酶原激活物（uPA、tPA）；③尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）；④纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）。tPA主要作为一种纤维蛋白依赖性酶在血管内发挥活化作用，这种作用主要参与血栓溶解及维持血液凝血和纤溶平衡等生理过程。uPA主要作用于细胞表面受体，结合为纤溶酶原活化物而发挥作用，控制细胞周围的蛋白溶解，在组织改建、细胞迁移、肿瘤侵袭转移及肿瘤血管形成等病理、生理过程中发挥重要作用，不需依赖纤维蛋白。uPA与其受体uPAR结合，激活纤溶酶原转化为纤溶酶，后者直接或间接激活基质金属蛋白酶协同降解ECM和基底膜的纤维蛋白、蛋白多糖、层黏连蛋白及纤维连接蛋白等主要结构成分。uPA本身也能直接降解ECM的部分成分。uPA与uPAR结合还可通过激活信号传导途径介导uPAR与玻璃体结合蛋白（vitronectin）、层黏连蛋白、整合素间相互作用，调节细胞的黏附、迁移、增殖和分化。PAI－1是有效的特异性uPA抑制剂，在生理条件下对uPA有极高的亲和力，需与玻璃体结合蛋白结合而保持活性。对维持细胞外蛋白降解平衡起重要作用。PAI－1以非共价键与结合在uPAR上的uPA结合，形成uPAR－uPA／PAI复合物，随后复合物被细胞内吞，在溶酶体酶的作用下，uPA／PAI－1复合物被快速降解，uPAR再循环至细胞表面与uPA、PAI－1结合形成复合物，如此反复循环，调节uPA活性及uPAR在细胞膜上的位置变化，维持细胞外蛋白降解平衡。PAI－1与整合素、玻璃体结合蛋白、纤维连接蛋白等相互作用并通过细胞内信号转导途径影响肿瘤细胞迁移、增殖及肿瘤血管形成。与PAI－1相比，PAI－2是uPA更具特异性的抑制剂，但不能与血清中玻璃体结合蛋白结合，在体内分布局限。纤溶酶一方面激活基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），引起ECM降解；另一方面又诱导产生PAI－1，使纤溶酶的产生受限，从而使纤溶酶的激活不至于过度，这样形成一个负反馈调节。

基质金属蛋白酶（MMPs）构成了ECM降解的最重要的蛋白水解系统，是在结构上具有极大同源性的一组锌离子依赖的内肽酶家族，在正常成年组织中仅低水平表达，但在血管或组织重构过程中其活性明显上调。其活性结构中均包括Zn2＋，同时需要Ca2＋的参与以维持其稳定性；需要在中性的pH值环境中发挥作用；其作用能被基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）所阻断。按作用的底物不同MMPs可分为以下几类：①胶原酶：间质胶原酶（MMP－1）、多形核胶原酶（MMP－8）、胶原酶13（MMP－13）；②明胶酶：明胶酶A（MMP－2）、明胶酶B（MMP－9）；③间质溶素：间质溶素1（MMP－3）、间质溶素2（MMP－10）；④膜型基质金属蛋白酶（MT－MMP）：Ⅰ膜型基质金属蛋白酶（MMP－14）、Ⅱ膜型基质金属蛋白酶（MMP－15）、Ⅲ膜型基质金属蛋白酶（MMP－16）、Ⅳ膜型基质金属蛋白酶（MMP－17）；⑤其他：基质溶素（MMP－7）、间质溶素3（MMP－11）、金属弹力蛋白酶（MMP－12）、釉质溶解素（MMP－20）、RASI－1（MMP－18／19）。国外的研究表明 ，糖尿病视网膜病变患者的视网膜前膜的MMP－2，MMP－9活性显著增强并过度表达。

可溶性MMPs都是以无活性的酶原形式分泌，然后在细胞间质内N－端结构域除去后被激活，才具有蛋白水解酶活性。血浆纤溶酶和间充质溶解素是已知的生理性MMPs激活因子。血浆纤溶酶由血浆纤溶酶原在uPA或tPA的作用下激活而来，因此，丝氨酸蛋白酶在MMPs的活化中起决定性的作用。MMPs可相互作用或与其他蛋白酶如纤溶酶作用，发生激活级联反应（图3－1）。

图3－1 MMPs的级联激活

激素、生长因子、癌基因和细胞周期素均可影响MMPs的转录。IL－1、IL－12、VEGF、表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、转移生长因子（TGF－β）、肿瘤坏死因子（TNF）、胰岛素样生长因子（IGF）均能上调MMPs的表达。PKC、ras和src作为MMPs调控生长因子的介质，也能调节MMPs的产生。TGF－α、干扰素γ、类固醇激素（包括糖皮质激素）和视黄醇则下调MMPs的表达。除上述各种因素外，MMPs自身的某些成分亦可调节MMPs的合成。金属蛋白酶的主要生理性抑制剂是组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）。

事实上，VEGF、TGF－β、TNF、IGF和MMPs之间存在正反馈调节环路：

（1）VEGF能够通过存在于血管平滑肌细胞上的VEGFR－1调节MMPS的表达，而MMPS又能降解细胞外基质释放更多的VEGF。

（2）正常情况下，TGF－β由于与TGF－β潜在相关蛋白（LAP）及潜在的TGF－β结合蛋白结合成复合物，一般都是以无活性的形式出现 ，在生长因子的作用下，TGF－β必须首先从这些抑制蛋白中释放出来，胶原酶、MMP－9及MMP－2可能参与TGF－β复合物的裂解作用；释放出的TGF－β则上调MMPs的表达。

（3）TNF－β作为一种膜结合蛋白需要通过裂解以释放其可溶性及有活性的配体。许多研究表明多种MMPs包括MMP－1、MMP－2、MMP－3、MMP－7、MMP－9均可能参与TNF－β的释放；活化后的TNF－β上调MMPs的表达。

（4）IGF－结合蛋白（IGFBPs），能阻止IGF与IGF受体的结合，MMPs通过裂解组织IGFBPs，解除IGF与其配体的结合；释放后的IGF上调MMPs的表达。

起初认为，基底膜和ECM中结构蛋白的破坏是细胞侵袭、转移的决定性步骤。因此，在过去的10多年中，研究兴趣大多集中在底物为结构蛋白的丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及基质金属蛋白酶上。事实上，糖氨聚糖作为ECM和基底膜的另一主要成分，其降解也是细胞侵袭前所必须的，硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）为此生物大分子带阴离子的多糖化合物侧链，乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）正是一种裂解糖氨聚糖中HS链的内切糖苷酶。体外研究发现活化的内皮细胞能够与 Hpa一起降解ECM。免疫组化观察Hpa在新生血管芽中表达，而在成熟血管中不表达。Hpa促进血管形成的另外一个重要因素，在于一些储存于ECM中的HS结合的生长因子，如bFGF在Hpa降解HS后被释放出来，可进一步刺激内皮细胞增殖。Hpa还促进释放uPA和tPA，二者使纤溶酶激活，纤溶酶除具有活化基质金属蛋白酶作用外，还具有促进HS结合型活性bFGF释放的功能。研究发现正常人白细胞中Hpa mRNA表达量低，而炎症发生时外周血白细胞特别是炎症周围血管内白细胞中Hpa mRNA表达明显升高。

基底膜和ECM的降解，使得储存于ECM中的生长因子及其前体如FGF、VEGF、HGF、IGF、EGF及TGF－β等被释放，VEGF、FGF等可直接刺激肿瘤新生血管形成，并上调内皮细胞表达uPA／uPAR。uPA也能直接激活某些生长因子，如uPA可以直接剪切VEGF，使之成为更具活性的VEGF189。生长因子与uPA、MMPs系统相互作用，形成正反馈调节环路，极大增加uPA产物和活性MMP，降解ECM及微血管基底膜，为内皮细胞迁移、增殖以及新生血管形成创造有利的微环境。