细胞-纵切扫描检测极性细胞蛋白定位

（一）实验目的

通过X-Z纵切可以得到样品不同深度的光学切片，其为断层扫描，可以记录样品表面及内部全面的生物学信息，对于细胞内某些极性蛋白可以精确定位。

（二）实验流程

以Olympus FV1000型共聚焦显微镜为例。

1.预扫描找到适宜标本（图像信噪比较好）。

2.选择Z轴扫描。

3.在Z扫描界面中设置合适的上平面、下平面和扫描间隔。

4.执行XYZ扫描。

5.待扫描结束后，存储系列图像。

（三）典型举例

钠离子依赖性二羧酸转运蛋白基因（Sodium-dependent dicarboxylate co-transporter，SDCT，NaDC）是负责三羧酸循环中间代谢产物转运和重吸收的膜转运蛋白家族。首先从肾脏中克隆出了人NaDC3和NaDC1基因，构建GFP质粒，并分别进行定点突变以明确其锚定功能区。转染猪近端肾小管上皮细胞（LLC-PK1）。绿色荧光显示NaDC3和NaDC1基因分别极性定位于肾小管上皮细胞的基底膜和顶膜，见图1-43、图1-44。

图1-43　NaDC3-GFP在猪近端肾小管上皮细胞基底膜膜和侧膜表达（×600）

A.LLC-PK1细胞转染突变型NaDC3△N1-16质粒；B.LLC-PK1细胞转染NaDC3△C34质粒；C.LLC-PK1细胞转染NaDC3△N1-6质粒；D.LLC-PK1细胞转染NaDC3△N8-16质粒

图1-44　NaDC1-GFP在猪近端肾小管上皮细胞的顶膜表达（×600）

A.LLC-PK1细胞转染野生型NaDC1-EGFP质粒；B.LLC-PK1细胞转染缺失突变NaDC1△N1-11质粒；C.LLC-PK1细胞转染嵌合体NaDC3N/NaDC1C质粒；D.LLC-PK1细胞转染野生型NaDC3-EGFP质粒

（四）注意事项

需要根据实验要求确定光学切片的厚度及Z轴步进距离，扫描完毕后，图片质量可通过调整机器参数获得最佳效果。

参考文献

[1]Bai X,Chen X,Feng Z,et al.Identification of Basolateral Membrane Targeting signal of Human Sodium-Dependent Dicarboxylate Transporter 3.J Cell Physiol,2006,206:821-830.

[2]Bai X,Chen X,Sun A,et al.Membrane topology structure of human high-affinity,sodiumdependent dicarboxylate transporter.FASEB J,2007,21:2409-2417.