细胞内钙离子震荡及钙火花检测

（一）实验原理及目的

细胞内钙信号传播存在时间和空间的组合形式，始发于胞浆中某一局部的Ca2+跃升，以一种反复瞬变的方式在细胞中传递，称为钙震荡（calcium oscillation）。在正常心肌细胞内，胞核和胞浆均存在小幅度钙震荡。

钙火花（calcium spark）是指细胞肌浆网上钙释放通道（RyR）自发开放或由单个L型钙通道开放触发引起的局部钙释放事件，是兴奋-收缩耦联的基本单位。其特点为局限在很小（约2μm）的亚细胞区域，不被转导，可单个散在或成簇状发放，亦可由邻近部位触发。

激光共聚焦技术能够检测细胞内钙离子震荡和钙火花的形成。

（二）主要实验材料

Fluo-3（1mg/ml储存液）探针、肾小球系膜细胞、Hank’s液。

（三）实验流程

1.细胞在共聚焦专用培养皿中培养，生长70%～80%融合。

2.细胞用Hank’s液洗3次。

3.将储备的Fluo-3（1mmol/L）用Hanks液稀释到终浓度7.5μmol/L。

4.置37℃的培养箱中孵育30min。

5.将染色后的样品用PBS洗2次。

6.置于60倍油镜观察区域及层面，用共聚焦显微镜观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。

7.钙离子震荡扫描　启动共聚焦显微镜，选择488nm氩离子激光，选择timecourse程序，设置扫描间隔时间（osec）（在此条件下时，FV1000共聚焦显微镜能够进行3帧/s的扫描）、扫描次数（300次）的扫描，储存为oib的动态文件。

8.钙火花扫描　启动共聚焦显微镜，选择488nm氩离子激光，选择线扫描程序（推荐选择直线，速度快，而且比较方便控制时间），在时间扫描上设定扫描次数如1000次，在最终图像上选择火花的区域，点击序列分析（series analysis）进行分析。

（四）典型举例

我们在研究胞浆钙调控规律的过程中，发现原代培养的系膜细胞内钙离子有其特殊的运动形式——钙火花、钙波和钙瞬变。在微观上，动态地观察了钙信号与系膜细胞收缩的关系，见图1-37和图1-38。

图1-37　单个系膜细胞胞内钙火花线扫描图像及软件分析结果

图1-38　单个系膜细胞胞内钙离子震荡及钙火花、钙波、钙瞬变的图像及分析结果

参考文献

[1]Feng Z,Wei C,Chen X,et al.Essential role of Ca2+release channels in angiotensin II-induced Ca2+oscillations and mesangial cell contraction.Kidney Int,2006,70:130-138