实验九 细胞因子的检测
细胞因子（cytokine）是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称。在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是基础免疫研究的有效手段，同时在临床疾病诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等方面具有重要价值。
一、白细胞介素－2的诱生与活性检测
实验目的
了解白细胞介素－2生物学活性的测定原理和操作过程。
实验原理
白细胞介素－2（Interleukin－2，IL－2）是活化T淋巴细胞分泌的一种淋巴因子，具有多种重要的免疫调节活性，可促进T淋巴细胞增殖，诱导或增强细胞毒性T淋巴细胞的杀伤功能，刺激B淋巴细胞增殖及分泌抗体，激活和增强NK细胞的自然细胞毒活性。IL－2对机体发挥免疫监视及杀伤肿瘤功能中发挥重要作用。
IL－2生物学活性的测定主要是依据IL－2能维持IL－2依赖性细胞株CTLL－2或活化的T淋巴母细胞的存活与增殖，且IL－2的活性与细胞增殖的速度和数量成正比。可以采用3H－TdR掺入法测定T细胞DNA的合成和MTT法测定活细胞的数量来反映IL－2的活性。本实验介绍目前最为常用的MTT法测定IL－2生物活性的方法。
实验材料
（1）细胞：CTLL－2细胞株或ConA（5mg/L）预活化的小鼠脾细胞。
（2）MTT溶液：将MTT按5mg/mL的浓度溶于0．01mol/L磷酸缓冲液中（pH值为7．4），过滤除菌后，于4℃处避光保存。
（3）细胞溶解剂：DMSO或10%SDS－0．01mol/L HCl。
（4）RPMI－1640培养液（含10%小牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素）。
（5）IL－2标准品。
（6）96孔细胞培养板，酶标仪、微量加样器等。
实验方法
（1）分离人外周血单个核细胞，调整细胞浓度至1×106个/mL，在24孔细胞培养板中每孔加入1．0mL细胞悬液，再每孔加入PHA（400μg/mL）置于37℃、5%CO2培养箱内孵育36h，离心，收取上清液，－20℃保存待测。
（2）上述细胞悬液加入96孔细胞培养板内，每孔100μL，再分别加入倍比稀释的待测样品及标准IL－2溶液，每孔100μL，每个稀释度做3个复孔，对照孔加不含IL－2的培养液100μL。
（3）混匀后将细胞培养板置于37℃、5%CO2中孵育32～40h。
（4）轻轻吸弃上清液100μL，加MTT 10μL/孔，振荡混匀1min，继续培养4～6h。
（5）每孔加盐酸异丙醇100μL，振荡30min后静置10min，然后用酶标仪分别测定波长570nm和630nm处的OD值。
实验结果
IL－2低于正常，提示T淋巴细胞或巨噬细胞功能低下，临床上对艾滋病、其他原发性免疫缺陷病以及红斑狼疮和实质性恶性肿瘤诊断有参考价值。
注意事项
（1）加MTT的最适时机是对照孔细胞开始全部死亡。
（2）细胞洗涤要充分，操作要无菌、轻柔，保持细胞活性。
二、酶联免疫斑点实验检测细胞因子
实验目的
了解酶联免疫斑点实验的技术原理，熟悉其操作过程。
实验原理
酶联免疫斑点实验（enzyme－linked immunospot assay，ELISPOT）是一种结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附测定（即ELISA）的免疫检测方法，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理是用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
图6－3 ELISPOT检测细胞因子原理的示意图
实验材料
（1）PHA：10μg/mL（终浓度）。
（2）包被抗体（coating antibody，Primary antibody）：抗人IFN－γ抗体。
（3）包被溶液（0．05mol/L、pH值为9．6的碳酸盐缓冲液）：Na2CO31．59g，NaHCO32．93g，加蒸馏水至1 000mL。
（4）洗涤液（0．02mol/L、pH值为7．4的PBS－0．05%Tween20）。
（5）酶标抗体稀释液：牛血清白蛋白0．2g，加洗涤缓冲液至100mL。
（6）HRP标记的抗人IFN－γ抗体。
（7）底物溶液。①AEC（3－氨基－9－乙基咔唑，Sigma A－5754）储存溶液：100mg AEC加入10mL DMF（N，N－二甲基甲酰胺，sigma D－4551），储存在玻璃瓶内。②0．1mol/L醋酸盐溶液：将0．2mol/L的（冰）醋酸148mL加入到352mL 0．2mol/L醋酸钠溶液中，加入水调整至1L，pH值为5．0；③333．3μL的AEC储存溶液加入10mL 0．1mol/L醋酸溶液中，0．45μm过滤器滤过，加入5μL H2O2（30%），即刻使用。
（8）加样器和枪头，吸水纸，洗涤瓶，小烧杯，37℃水浴箱，Biosys Bioreader4000PRO自动读板仪等。
实验方法
（1）将适量捕获性抗体抗人IFN－γ预先包被于96孔ELISPOT板上，4℃孵育过夜。将板用PBS洗3遍，再用含10%胎牛血清（FCS）的培养基封闭，室温下孵育至少1h。
（2）将细胞样品外周血单核细胞（PBMC），用含10%FCS的培养基稀释，分装于ELISPOT板孔中，再加入特异的刺激物，阴性对照孔中只加入培养基，阳性对照孔加入植物血凝素（PHA 10μg/mL），在37℃，5%CO2的培养箱中培养24h。
（3）用含0．01%Tween20的PBS洗6次，弃去细胞，加入生物素化抗人IFN－γ的检测抗体，孵育3h。
（4）洗6次后，加入HRP标记的链亲和素，室温孵育2～3h。
（5）用PBS－Tween20再洗5次，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干。
（6）解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温避光静置20～30 min。
（7）待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10～30min，让膜自然晾干（注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂）。
（8）将ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000PRO自动读板仪内，调节好参数，并记录斑点的各种参数，作统计分析。
实验结果
阳性细胞（也称斑点形成细胞，spot forming cell SFC）数目的统计：每一个ELISPOT斑点对应唯一一个阳性细胞（可以人工计数，也可以使用自动读板仪来计数）。
注意事项
（1）Wash Buffer的Tween20可导致背景过强，可多用PBS Tween20清洗1～2次，显色反应前用PBS洗板并适当延长风干时间。
（2）实验后，微板要置于温度在37℃以下处，否则会损坏微板。
（3）在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板，并尽量减少开关培养箱的次数（碰撞会引起细胞移位，造成斑点模糊，拖尾）。
（4）整个实验设置1组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品要设置1组负对照（不加刺激物），整块板还要加1组背景对照（不含细胞，只加培养基和所有检测试剂），均设复孔。
思考题
（1）如何从细胞因子检测的角度了解机体T淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞的功能？
（2）ELISPOT的原理、用途是什么？它与ELISA的异同是什么？
（3）流式细胞术有哪些临床应用价值？流式细胞分析系统可以检测哪些项目？
（汪洪涛）
［1］李柏青，张林杰．医学免疫学实验教程［M］．合肥：安徽科学技术出版社，2004．
［2］刘辉．临床免疫学与检验实验指导［M］．北京：人民卫生出版社，1999．
［3］金伯泉．医学免疫学［M］．5版．北京：人民卫生出版社，2008．
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