（一）实验目的
掌握共聚焦显微镜检测活细胞内荧光信号动态变化。
（二）实验流程
1.样本准备 将接种于petri皿中的细胞进行相应细胞离子染色。
2.启动共聚焦显微镜 打开显微镜、激光器、系统软件等组件进入正常使用状态，设置常规参数。
3.扫描图像预览 待测样本置于载物台上，调节并聚焦样本，获得最佳图像效果。
4.应用ROI功能于视野中分别选择8～10个细胞。
5.选择相应的扫描方式 XYtmode，此种方式为平面扫描，监测某一细胞层面的荧光强度随时间变化。
6.设置时间扫描（TimeScan）程序 在时间扫描界面中设置合适的时间间隔（interval）和取图数量（num）。也可以根据实验需要设置一个或多个连续的时间程序，此种方式需要将每个时间程序依次连接起来，并设置程序之间的间隔时间。
7.打开series analysis工具 以实时记录荧光随时间变化曲线。
8.选定细胞 于预览的图像中应用ROI工具选定8～10个细胞。
9.开启ZDC（Z轴防漂移系统），因为长时间扫描以及动态加药过程会导致细胞层面偏离焦平面，图像变虚，此功能则很好的解决这一问题。
10.启动扫描 动态扫描时间程序全部完成后，仪器自动停止记录。立即存储图像。
11.定量测定 获得每个细胞荧光强度随着时间变化曲线。
12.相对荧光定量法 比较对照组和实验组动态曲线上升的斜率；不同时刻上升幅度的大小（尤其当有峰值时）；统计检验差异。
13.细胞内离子浓度估算 以Ca2+为例，细胞内Ca2+离子浓度可用如下公式进行估算：
（Ca2+）i=Kd×
Kd：荧光探针的Ca2+解离常数。
Fmin：为无钙时细胞内平均荧光强度。
Fmax：为钙饱和时细胞内荧光强度。
F：为测定时细胞钙浓度下，荧光探针与钙正常结合时细胞内荧光强度。
利用标准曲线法求出细胞内钙：测定一系列已知钙离子浓度标准溶液中细胞内的荧光强度，求出所需实验组的细胞内钙浓度。
（三）注意事项
1.当细胞状态不好时，可能会造成离子基础值升高或降低现象，细胞对外界刺激反应很弱或无反应，故务必要保持细胞的正常活性状态。
2.在满足扫描图像质量的前提下，尽量减少激发光强度，防止荧光淬灭，避免造成人为实验误差。
（四）相关文件
FV1000 user manual.OLYMPUS.INC.2010
[1]Paddock SW.Confocal Microscopy Methods and Protocols.New Jersey:Humana Press,1999:261-303.
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