肾脏细胞电转方法

（一）实验目的

电转染法通过外加电场的瞬时电击使细胞膜形成微孔，外源基因能够通过可逆孔洞进入细胞得以表达，该方法适用范围广，转染效率高，并且能够一次转染大量细胞，可以满足基因功能研究的需要。

（二）实验试剂

1.真核表达质粒。

2.RPMI1640培养液　5μg/ml胰岛素（insulin），5μg/ml转铁蛋白（transferrin），100U/ml青霉素（penicilin）、链霉素（streptomycin）。

3.电转仪、电击杯（0.4cm、200ohms）。

4.电转染缓冲液　20mmol/L HEPES、137mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、0.7mmol/L Na2HPO4、6mmol/L Glucose、0.1mmol/L β-mecaptoethanol。

（三）实验流程

以大鼠肾小球系膜细胞系（ratmesangial cell，RMC）为例。

1.肾小球系膜细胞系RMC的培养　原代RMC于含15%胎牛血清的原代细胞1640培养液中，置37℃，5%CO2孵箱中培养。

2.将细胞融合程度达到　70%～80%的RMC常规胰酶消化，1200r离心5min，弃上清，加入700μl电转染缓冲液，混匀，加入40μg质粒，混匀，室温孵育10min。

3.将上述细胞-质粒的混合物移入电击杯，以550μF电容和340V电压组合进行电转染。室温静置10min，再铺入6孔板，置37℃、5%CO2孵箱中培养。

4.24h后，收集细胞，观测转染效率，进行后续实验，图1-15、图1-16为不同转染效率的RMC的荧光图。

图1-15　转染GFP的系膜细胞，转染效率20%。荧光显微镜下的形态（×100）

图1-16　转染GFP的系膜细胞，转染效率90%。荧光显微镜下的形态（×100）

（四）常见问题及注意事项

影响电转染效率和细胞活力的因素有很多，其中电压、电容是影响转染效果的重要因素。

1.如何提高转染效率？

答：特定强度的电压可以造成细胞胞膜穿孔（称为穿孔电压），随着电压的增大，穿孔直径也逐渐增大，有利于DNA分子进入细胞。而电容与电压持续时间呈正相关，随着放电时间的延长，电穿孔数目增多，转染效率也随之提高。通常较低的电压与电容组合会导致脉冲穿孔条件不充分，电转染效率不佳。而过高的电压和电容组合则会使细胞膜穿孔数量增加或者孔径激增，导致膜组织断裂、细胞凋亡，影响细胞活力。

2.为什么会有细胞死亡？

答：适当提高电容确实能够提高电转染的效率，但同时也增加了细胞的死亡率。

3.什么样的质粒DNA浓度及细胞密度适合转染？

答：质粒DNA浓度和待转染细胞状态也会影响到电转染效果。可以进行预实验，选取合适质粒浓度获得较佳的电转染效果。而细胞融合度在70%～80%处于对数生长期的原代RMC生命力旺盛，细胞膜恢复能力强，有利于增加电转染成功率。

参考文献

[1]徐峰，吕杨，谢院生，等.原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件的探索和验证.军医进修学院学报，2010,31:459-461.

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