豚鼠毛细胞胞内电位记录方法

为深入研究噪声暴露后载体时耳蜗外毛细胞个体功能变化规律，我们在20世纪90年代中期于我们的实验室成功地记录到内毛细胞、外毛细胞、支持细胞胞内电位和在中阶里记录到场电位，并观察了其变化规律，本节着重阐述外毛细胞胞内电位记录方法及其电位特点。

（一）刺激声及其校准

1．刺激声　与大多数用于胞外感受器电位记录所用的刺激声一样，用于外毛细胞胞内电位记录的刺激声可为短纯音（上升/下降为2ms，平台为20ms），刺激耳机可用ER－10C插入式耳机或其他高频耳机。刺激声参数可设计成两种步骤记录：固定刺激声强度改变刺激频率，或固定刺激声频率改变刺激声强度（10～100dB SPL）。在记录过程中，可同时记录圆窗处的CAP阈值，用于监测耳蜗功能。

2．校准

（1）声音校准：耳机输出强度需要用标准的计量仪器进行校准后才可使用。校准的方法很多，一种常用的方法是用声级计对高强度的声音测量，再根据衰减器的读数对其他强度的声音进行设置。因耳机在不同的频率下的输出敏感度不同，不同的频率的输出需进行分别校准。值得注意的是，不同尺寸的麦克风的频响曲线也不相同，对不同频段的声音校准声，需要选用相应的麦克风。耳机的输出还可根据麦克风的输出来校准，因为某一麦克风的输出敏感度是恒定的，若麦克风的敏感度一致，则可通过测量麦克风的电压输出来计算声音的强度。例如，若某一麦克风对94dB SPL输入声的输出为1mV，则输出电压为x毫伏的声音强度，可用如下公式得出：94＋20log（x）（dB SPL）。

（2）鼓膜处声压级校准：若采用近场声刺激（耳机靠近外耳道），系统校准后，每次实验前应进行鼓膜处声压计校准。校准时，先将带有套管的耳机插入豚鼠测试耳的外耳道，并用支架固定好耳机，然后用ER－10C耳机中的麦克风对ER－10C耳机发出的刺激声强度进行记录，鼓膜处的声压级强度可通过麦克风的电压读数和敏感度来计算。

（二）外毛细胞（OHC）胞内记录

参照Dallos P等描述的外毛细胞的记录方法（Dallos　1985），我们对豚鼠耳蜗毛细胞电位非线性特性及在噪声暴露后的改变进行了研究，具体记录方法描述如下。

1．微电极的拉制　可用外径为1～1．85mm有芯玻璃管拉制，用于细胞内记录的电极，电极尖端需＜1μm以减小对毛细胞的损伤。微电极的尖端大小可用电极阻抗来衡量，一般用于毛细胞胞内记录的电极阻抗应在80兆欧姆以上（内充液为3mmol的氯化钾溶液）。

2．中阶电位的记录方法　豚鼠麻醉后，用自制头固定架固定，行气管插管，上呼吸机以减少自主呼吸产生的振动。从腹侧入路打开听泡，充分暴露耳蜗，在体视显微镜下于耳蜗第3圈螺旋韧带处开一0．3～0．6mm小窗（花色豚鼠的螺旋韧带有色素沉着，可用来判断螺旋韧带的位置）（图10－4）。螺旋韧带下为中阶，其中液体为内淋巴液。中阶两侧为前庭阶和骨阶，其内充满外淋巴液。内淋巴液的成分与外淋巴液截然不同，保持内、外淋巴液的离子浓度差是保持毛细胞功能和维持听力敏感性的前提，因而手术过程中不可损伤前庭阶和鼓阶。打开骨壁后，调整微电极与耳蜗骨面的角度大约90°，粗调使电极尖端与小窗液面接触，然后将微电极放大器的直流读数复位为零以便于计算电极的插入深度。

图10－4　直流电位的极性变化与电极位置

3．电位记录　在电极推进中阶前，电极阻抗需进行载体测定以确定电极尖端的状态。电极尖端的堵塞或在操作中折断，在记录过程中常常出现。电极尖端堵塞，会直接妨碍电位的记录，而电极尖端在操作中折断会造成电极尖端过大，而对耳蜗造成机械损伤，从而影响耳蜗功能。待确保电极阻抗在合理的范围内后，微电极在微操纵器控制下，以每步一微米的步距向基底膜方向推进。胞内记录常采用电控制的步进式推进器，原因是步进距离容易控制。当放大器的直流读数显示出现一正向直流电位时，表明记录电极进入了中阶，记录电位为内淋巴电位（EP）。正常的内淋巴电位应＞60mV，若内淋巴电位低于60mV，可能在手术过程中造成了内、外淋巴液混流，从而影响了内淋巴电位。当然放大器的直流漂移，也可造成放大器读数的改变。遇到此情况，可退出电极，在耳蜗液面复零后重新记录。若确认内淋巴电位的下降确实为耳蜗受损，则只能将动物舍弃，这在实验初期是很难避免的。

在电极刚刚进入中阶后记录到内淋巴电位后，可将微电极操纵器的位移计数器复零，以此为起点计算进入耳蜗中阶的深度。在监测内淋巴电位的同时，可用0．8kHz的短纯音（50dB SPL，平台时间20ms，上升/下降时间为2ms）为探测音，在电极进入中阶的同时，监测耳蜗微音电位的幅度，电位大小可在电脑屏幕上监示。电极向基底膜方向推进，在200μm范围内，若记录到一直流负电位（－50mV以下），而交流感受器电位（CM）并未明显增大，则可能记录到了支持细胞；若电极继续推进，记录到一直流电位幅度在－40mV～－70mV之间，而交流感受器电位突然增大，幅值达到中阶处电位2倍以上，则可能记录到了外毛细胞或内毛细胞胞内电位。可注入细胞标定液，对记录的细胞进行实验后标定。

（三）正常耳蜗外毛细胞胞内交流感受器电位的特点

胞内记录电位难度较大，图10－5示正常豚鼠的交流感受器电位的波形（A）和幅度－强度曲线（B）。图10－5A显示不同刺激声强度下的外毛细胞胞内交流感受器电位波形，刺激声为0．8kHz短纯音刺激，在刺激声为20dB时，仍可见反应波形，80dB SPL时幅度最大，然而在100dB SPL时，其反应幅度反而减小。取外毛细胞在0．3kHz、0．8kHz和1．3kHz时的平均值（表10－1），电位幅度以dB表示（以1．08μV为0dB），可见在10～40dB SPL时，其曲线基本上呈线性增长，平均斜率似近为1；刺激声为50dB SPL时，幅度增长速度减慢，交流感受器电位幅度不再随刺激强度增加而呈线性增加；当刺激声强度达到80dB SPL时，反应幅度较低强度略有下降。输出幅度强度曲线在高强度刺激声下出现饱和状态（图10－5B）。

图10－5　豚鼠外毛细胞胞内交流感受电位（0．8kHz短纯音）

A．交流感受电位波形；B．交流感受电位幅度－强度输入输出（I/O）曲线。刺激声频率为0．3、0．8和1．3kHz

表10－1　正常外毛细胞电位幅度（χ－±SE，n＝7）（dB）

（四）噪声暴露对耳蜗外毛细胞交流感受器电位的影响

如果用100dB SPL白噪声对测试耳暴露以诱导出暂时性听力损伤，暴露后即刻记录的外毛细胞交流感受器电位波形见图10－ 6。图10－6A可见交流感受器电位在30dB SPL时才见反应，显然较正常耳蜗其敏感度下降。图10－6B示白噪声暴露后3个不同动物的外毛细胞感受器电位平均值（表10－2）的幅度－强度输出曲线，低声强刺激时，其电位幅度明显减弱，与对照组相比较，暴露后的非线性减弱，0．3kHz、0．8kHz和1．3kHz的幅度－强度输出曲线的平均斜率由暴露前的0．51、0．44和0．46增长为0．72、1．0和1．05，提示线性特性增强。

表10－2　噪声暴露后外毛细胞电位幅度（χ－±SE，n＝3）（dB）

图10－6　白噪声暴露对毛细胞感受器电位的影响

A．噪声暴露后的交流感受器电位波形，刺激声为0．8kHz的短纯音；B．白噪声暴露后交流感受器电位的幅度－强度输出曲线（I/O），刺激声为0．3、0．8和1．3kHz的短纯音

（五）感受器电位的非线性特性

外毛细胞通过其主动反馈机制（外毛细胞的电能动性）可提高基底膜振动的敏感性，这一主动机制仅在较低的声刺激强度下（10～40dB）增加基底膜的振动幅度，而在高声强下则无此作用。外毛细胞在低刺激声强度下的主动机制可增加基底膜的振动幅度，进而增加内毛细胞的感受器电位的输出，从而增加听神经的输出，即在低声强下增加耳蜗的敏感性。外毛细胞在高声强时不增加耳蜗的机械振动，从而在高声强下对耳蜗起保护作用。最近的文献发现，毛细胞的电能动性是由外毛细胞侧壁上的prestin蛋白在不同膜电压下构象发生改变来实现的（Zheng，Shen et　al，2000），prestin基因敲除小鼠，外毛细胞不再具有电能动性，而小鼠的听力下降30dB左右（Liberman，Gao et　al，2002），这与以上的推论非常吻合。外毛细胞的主动机制在感受器电位的幅度上表现为非线性特性，因而如果外毛细胞的电能动性受损害，则感受器电位表现出线性特性。由于噪声暴露首先影响外毛细胞的能动性，而不影响内毛细胞的反应，而内毛细胞不具有主动机制，因而在噪声暴露后耳蜗呈现线性特性。此时外毛细胞主动机制受损，内毛细胞的反应占优势，所有的反应在低刺激声时均降低，而对高声强的反应不受影响，临床表现为响度重振现象。当外毛细胞功能受损时，必定导致增益的减小，其听力下降一般在30～40dB以下，进一步的听力损伤则必定包含有内毛细胞的损伤。耳蜗外毛细胞的能动性可通过耳声发射的测量来衡量，临床测试表明，若听力损伤在30dB SPL以内，耳声发射仍可记录到；若听力损失超过30dB以上，耳声发射往往全部消失。尽管耳声发射还不能定量测试外毛细胞缺失的多少，通过测试不同频率的畸变产物耳声发射，可评估不同部位上的外毛细胞的状况。但对于内毛细胞是否完好，无论是动物实验还是临床测试，都还未有很好的测试手段。内毛细胞功能的检测方法的建立，对认识内毛细胞的损伤在噪声性聋、老年性聋及突发性聋的作用将起到至关重要的作用。也许作为场电位记录的CM之I/O曲线如果呈线性特点可提示内毛细胞是正常的。