微生物基因工程的工具酶

对DNA片段进行操作，必须要运用能“切短”DNA的得心应手的工具。工具酶就是用于对不同来源的DNA片段进行切割拼接组装。在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。在构建重组DNA时，需要DNA连接酶催化，使目的DNA片段与载体DNA进行连接。

1.限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）简称为限制性酶（restriction enzyme），是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。在细菌细胞内限制性酶可以降解外源的DNA分子，而细菌DNA甲基化，可以避免本身DNA分子被酶降解。这是生物的保护机制。

限制性酶可分成三类：Ⅰ类酶，结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA。 Ⅲ类酶，在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。以上二类酶兼有切割和修饰（甲基化）的作用，并依赖于ATP的存在。 Ⅱ类酶，由二种酶组成，一种为限制性内切核酸酶，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。至今已分离出600多种Ⅱ类酶。限制性内切酶在分子克隆中得到广泛应用，是重组DNA的基础。一些常见的限制性酶见表7-1。

表7-1 一些常用限制性酶的识别序列及其产生菌

Ⅱ型限制酶的识别序列通常由4～8个碱基对组成，这些碱基对的序列呈回文结构（palin-dromic structure），旋转180°，其序列顺序不变。所有限制酶切割DNA后，均产生5′磷酸基和3′羟基的末端。限制酶作用所产生的DNA片段有以下两种形式：① 具有黏性末端（cohesive end）。有些限制酶在识别序列上交错切割，结果形成的DNA限制片段具有黏性末端。例如， HindⅢ切割结果形成5′单链突出的黏性末端，而PstⅠ切割结果却形成3′单链突出的黏性末端。 ② 具有平末端（blunt end）。有些限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如SmaⅠ切割结果形成平末端。

同裂酶（isocaudomers）：来源不同的限制酶，识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成的重组序列仍可能被原来的限制酶所切割。同裂酶之间的性质有所不同（如对离子强度、反应温度以及对甲基化碱基的敏感性等）。

同尾酶（isocaudomers）：来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生相同的黏性末端，这类限制酶称为同尾酶。两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。Eco RⅠ和MunⅠ均属同尾酶。

图7-2 限制性核酸内切酶Eco RⅠ的作用（引自The National Health Museum，1999）

2.DNA连接酶

将不同的DNA片段连接在一起的酶叫DNA连接酶。DNA连接酶主要来自T4噬菌体和大肠杆菌。DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5′端磷酸与3′端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA片段进行连接。DNA连接酶主要有两种：一种是T4DNA连接酶，另一种是大肠杆菌DNA连接酶。T4 DNA连接酶由一条多肽链组成，相对相对分子质量为6800Da，通常催化黏性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。催化反应需要Mg2＋和ATP，ATP作为反应的能量来源。T4DNA连接酶在基因工程操作中被广泛应用。大肠杆菌DNA连接酶的相对相对分子质量为7500Da，连接反应的能量来源是NAD＋，此酶催化DNA连接反应与T4DNA连接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平末端连接。

体外DNA连接方法目前常用的三种：①用T4或E.coli DNA连接酶可连接具有互补黏性末端的DNA片段；②用T4DNA连接酶连接具有平末端DNA片段；③先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成黏性末端，然后再进行连接。