基因工程的内容

基因工程的主要程序包括：目的基因的取得，载体的选择，限制酶等酶系的选用，体外重组体的构建、转化，目的基因在受体细胞里的增殖与表达。以上过程的每一步，都是非常复杂和困难的，但其中的任何一点进展，都是遗传学发展的一项重要标志。

（一）目的基因的获得

目的基因的获得主要有两种方法：一是从生物样品中提取，二是人工合成。

目的基因是进行基因嫁接的“接穗”，或者说是准备用来替换遗传病患者缺陷基因的正常基因。想要从天然物中分离到这种基因，首先需要解决单个基因分离、纯化的技术手段问题。如果工程目标比较特殊，不易从天然物中分离到“目的基因”，就只能在实验室合成这种基因。一旦获得目的基因，还必须让它们繁殖一定的数量，并使其保持活性。

1969年，美国哈佛大学的科学家第1次分离出纯的单一基因。从一定程度上说，从生物细胞中直接分离符合“工程”计划要求的目的基因，要比人工合成这种基因困难得多。因为在高等生物中，基因很少单个存在，而且数量极大，很难将它们识别并分离出来。

第1次人工化学合成基因是在1976年，美国科学家花了21年的时间，终于合成了大肠杆菌的酪氨酸tRNA基因。人工合成基因的方法难度很高，需要掌握目的基因的详细结构及许多很复杂的相关问题。比如：工具酶的提取极不容易；合成操作复杂；副反应多，因而杂质剔除亦难。此外，实验设备和药品也相当昂贵。更困难的是，某些基因的核苷酸片段较长，人工合成这样的大分子暂时还不可能。于是，人们设计出另一种基因合成方法——模板合成法。基因工作指令传递即遗传信息的传递按照“DNA→RNA→蛋白质”这一方向进行。RNA病毒的发现和研究，证实了反转录即由RNA→DNA的信息传递方向也存在。所谓基因的模板合成法，就是要像艾滋病病毒HIV那样，以mRNA为模板，先反向转录出一条DNA单链（cDNA），再以互补的方式加倍成DNA双链。从mRNA到DNA的关键是要有反转录酶。这种酶最早由诺贝尔奖金获得者、英国科学家伯蒂摩尔和泰米在1970年分离出来。1976年，前苏联科学家易列希蒂首次从兔细胞中分离出一种球蛋白mRNA，并以此为模板合成了有580个碱基对的家兔球蛋白基因，并通过基因移植手段，使兔基因在大肠杆菌中合成了兔球蛋白。

（二）基因载体

目的基因的大量制备，首先需要将所需目的基因DNA片段与载体连接，通过载体进入受体细胞，并能进行自我复制（增殖）。载体实际上也是DNA。

1．基因工程载体的主要特点　①能在宿主细胞中复制繁殖，并有较高的拷贝数，这是基因载体所必备的条件；②容易进入宿主细胞；③具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，即选择性多克隆位点；④有容易被识别筛选的标志。

2．常用的载体　主要有质粒、λ噬菌体、病毒等。

质粒可以在不同细菌菌系之间，甚至在不同种细菌之间进行交流，使细菌的耐药性基因得以互相转移。它是细菌中普遍存在的一种核外遗传物质，是一种环形的DNA结构，也像病毒一样能够自体复制。如将外源DNA安装在质粒DNA环上，外源DNA在质粒自体复制时也能得到复制。

（三）酶的选择

把合乎人的意愿的基因移植到所要转化的生物的染色体序列中，更是一件不容易的事。制备各种必要的酶，是基因操作的必要条件保证。

细胞中有两类酶，一类是促进DNA嫁接或者说“缝合”的连接酶；另一类是专门在DNA上寻找各自特定的“切点”，认准后就“下刀”的内切酶，或称为限制性内切酶。限制性内切酶可以剪切特异性DNA片段。连接酶和限制性内切酶都是基因移植操作所必备的“工具”，故被称为工具酶，并有基因手术“缝合针”和“分子手术刀”的称誉。

当然，除了这两类酶外，还需要许多其他的酶，如反转录酶、各种合成酶以及能对基因“接头”进行修饰以利“安装”的多核苷酸末端转移酶等。

（四）目的基因和载体基因的连接

在遗传学中，将目的基因连接在载体上的过程叫基因体外重组。基因体外重组的基本条件是：两种基因（即载体基因和目的基因）要有互相匹配的“接头”。让我们设想一下，两条双链DNA要牢固地连接起来，接头应是什么样子？无疑两者的接头都要留出一个长度相等的半边链的“尾巴”才好。这样，对接时，两“尾”相对扣合，“严丝合缝”。而且由DNA双链之间的互补关系决定，双方“尾巴”上的碱基应成互补关系，才能“粘”得牢。而多数限制性内切酶恰恰具有这种特性，当它们“切”开DNA双链时，DNA双链上的断口并不在一对碱基上，因而断开的端头上就有适于组接的“尾巴”，也称之为“黏性末端”。由于一种内切酶只识别一种切口，而一条DNA上又不止一处有相同切口位点，因而一条足够长的DNA被一种内切酶处理后，会被切成长短不同的许多DNA片段，任何两段都可以找到互补端，而且一条片段的两端也可以对接。

不难理解，在进行基因体外重组时，只要将载体DNA和含有目的基因的DNA链用同一种合适的内切酶去处理，两者切口上便具有相同的互补黏性末端，在连接酶的作用下，它们就会连接在一起，而接口上又恢复原来的基因碱基顺序。

有时，目的基因和载体DNA都缺少黏性末端（有的内切酶切口是平整的），这就需要用人造末端法来进行重组前的加工。简单地说，在特定的条件下，按照酶切形成的黏性末端位置，给两种DNA的平整末端各加数个大致相等、又互补的脱氧核糖核苷酸，如给一种DNA片段加脱氧腺苷酸（dAMP），而给另一种加脱氧胸苷酸（dTMP）。这样，在目的DNA和载体DNA混合时，相互互补的末端便把两者连接在一起，实现体外重组。

（五）重组DNA导入受体细胞

让载体进入目标细胞的导入方法很多，可因不同载体的情况而异。

例如以病毒为载体时，“改装”了的病毒以“感染”的方式进入被转化细胞，在多种酶的作用下，目的基因进入预定位置，而病毒却被“消灭”。质粒载体有多种，而且大都是经过改造的，所以都有已知的切点和运载对象。当某种目的基因适于某种质粒作载体时，用工具酶将目的基因组装在质粒DNA环上，然后采用某种方法，例如用氯化钙处理受体细胞，以提高细胞膜的通透性，然后在低温下孵育，质粒就可以进入受体。此外，还有其他载体以及其他介导方法，如脂质体、转位子、显微注射等。

（六）重组体的筛选与表达

目的DNA导入受体细胞的过程是我们肉眼看不到的，要知道导入是否成功，事先应根据表达特性找到特定的标志。例如，我们用一种经过改造的四环素抗性质粒作为载体，将一种基因移入自身没有四环素抗性的大肠杆菌中时，如果转化试验后大肠杆菌不能被四环素杀死，就可以确定转化是成功的。