一、目的要求
学习和掌握植物病原菌的一般接种方法及接种体的制备，在温室人工接种条件下观测病原菌的侵染过程，包括孢子萌发、附着胞的形成等病菌扩展过程，直至病害症状显现，并明确病原菌与寄主植物寄生关系的定义以及病害侵染与病害循环的关系。
二、材料和用具
（一）实验材料
1.菌种材料
（1）玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）
（2）瓜类绵腐病菌（Pythium a phanidermatum）
（3）甘薯黑斑病菌（Ceratocystis fimbriata）
（4）马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicum）
（5）棉花炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）
（6）甘蓝黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris）
2.寄主材料
玉米苗、红薯块、棉籽、丝瓜种子或丝瓜幼苗、马铃薯块、甘蓝叶片。
（二）实验用具
小剪刀、显微镜、酒精灯、解剖针、喷枪（喷雾瓶）、小盆钵等。
三、内容和方法
（一）实验原理
从病株上分离得到的真菌、细菌是否是致病菌，要通过对寄主植株接种该病菌，看是否能诱发该植物产生与原来病株相同的症状才能确定。 植物病理的接种技术是病理学最常用的基本技术之一，它可以用来鉴定病原物的致病性，选育抗病品种，研究病害发生过程等。
接种方法一般采用与自然条件下发病相似的办法，因此接种类型比较多。在进行病原物接种时，无论采用什么方法，都必须考虑：（1）寄主植物的感病性——供试植物应是感病品种，在易感病的发育阶段接种；（2）病原物的致病性——菌种应具有较强的致病力，生活力强，有一定的接种量；（3）要创造适宜的发病条件，主要是温度和湿度，以利于病菌的萌发和侵入。
（二）实验方法
1.喷雾接种法
喷雾接种是将病菌的悬浮液，喷洒在寄主植物表面。 经气流和雨水传播的病害都可以用此种方法接种。 病菌到达寄主植物表面，经气孔、伤口侵入或经表皮直接侵入。 本实验以玉米小斑病为例，主要步骤如下。
（1）配制孢子悬浮液：在玉米小斑病菌斜面试管内加5m L灭菌水，用移植针轻轻在斜面上拨动，洗下孢子，用2层纱布过滤，制成孢子悬浮液，显微镜下镜检，并计算孢子浓度。
（2）将配制好的孢子悬浮液装入喷雾瓶中备用。
（3）取健康玉米植株，用棉花轻轻抹掉叶片上的叶面蜡质，将孢子液喷于叶片上，主要喷叶背面。
（4）接种后，保湿24~36h，放在室温下，诱发症状，要求保持土壤湿润，温度在20℃左右，即可观察发病情况。
提示:在配制孢子液时可滴加少许2%的吐温-20,以利于孢子黏附在叶片上。
2.针刺接种法
由伤口侵入的病害，可以采用伤口接种。 一般是用灭菌的针刺伤寄主植物组织，然后将病菌接种在伤口内，可用此方法接种甘薯黑斑病菌和马铃薯环腐病菌。
（1）将块根、块茎切成片或直接在块根、块茎上刺出伤口。
（2）用接种针挑取病菌涂抹在伤口上，或者用消毒脱脂棉蘸取病菌孢子悬浮液、细菌液涂抹伤口。
（3）接种完后保湿，在25℃条件下培养，3~7d后观察发病情况。
3.剪叶接种法
此方法适宜经水孔、伤口侵入病害的接种，用此方法接种甘蓝黑腐病菌，操作步骤如下。
（1）配制细菌悬浮液：在甘蓝黑腐病菌斜面试管中加5m L灭菌水，振动试管，使细菌分散在水中形成悬浮液，悬浮液中细菌浓度为1×107个/m L左右，将悬浮液倒入小烧杯中。
（2）用在火焰上灭菌的小剪刀在烧杯中蘸取细菌悬浮液，然后用剪刀剪甘蓝叶片。
（3）接种完后保湿，在25℃条件下诱发症状，5~7d后观察症状。
4.土壤接种法
有些病菌是在土壤中越冬越夏，当播种寄主后，病菌随着寄主的萌发生长从根部或地下茎侵入寄主。 用此方法接种瓜类绵腐病菌，操作步骤如下。
（1）把培养的瓜类绵腐病菌，连同少量培养基，拌在土壤中。
（2）把已发芽的丝瓜种子播在该土壤中或者将丝瓜苗移栽于该土壤中。
（3）在25℃室温下培养，保持土壤湿润，10~15d后观察症状。
5.浸种接种法
（1）将已脱绒的棉花种子在56℃的恒温水中浸泡30min，取出稍晾干。
（2）在棉花炭疽病菌斜面试管内加入5m L灭菌水，制成孢子悬浮液。
（3）把用温水浸泡后的棉花种子浸泡在孢子悬浮液中10min，然后将种子播种于无菌土壤中，每钵10粒种子。
（4）接种完后，在20℃条件下培养，注意土壤保持湿润，10~15d后观察症状。
（三）注意事项
1.喷雾时，以细雾滴但不形成水膜为最佳。
2.每种接种方法都应设置对照。
四、实验学时
6学时。
五、作业与思考题
1.每人交发病植株1~2棵（叶片2~3片），并完成实验报告1份。
2.针对不同的病原物应如何选择接种方法？
3.喷雾接种时加吐温-20的作用是什么？
4.依据实验分析讨论病害发生及流行的三要素。
5.设想让玉米小斑病在温室中继续发展下去，能否观察到病原菌的第二、三代孢子？
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