探究土壤里微生物使用什么工具

二、土壤中的微生物

土壤微生物包括微生物中各种分类和功能类群，涵盖按16SrRNA系统发育分类的三界生物。直接抽提的DNA研究发现每克土壤有多达1 000～5 000种不同的基因型，主要类群包括病毒、细菌、真菌、藻类和原生动物。病毒存在于土壤细菌、真菌、植物和动物中，通过寄生对这些生物产生调控作用，特别是可作为原核生物遗传物质交换的重要载体。细菌是非常重要的土壤生物类群，大部分土壤都有主要的分类类群，DNA分析表明种类多达13 000种。土壤真菌大部分是有机异养菌，它们的形态和生活周期极其多样，在许多生态系统中(如森林)构成土壤生物的最大生物量，种类极为丰富，至今有70 000个真菌种被鉴定。由于真菌易于产生抗性结构(如孢子)而能耐受严峻的环境条件，又由于以菌丝状态存在而不易被捕食。藻类能从大部分土壤中培养出来的，在光照强烈，高含水量土壤表面含有大量的藻类群体。

1.微生物在多孔土壤中的存在状态

土壤中大部分微生物是附着的。研究证明大约80%～90%的细胞被吸附在固体表面，其余是游离的。附着的微生物以斑块或集群(pathes or colonies)的方式存在于颗粒表面。附着和生长成集群对微生物(特别是细菌)来说具有许多优点(参阅本章第六节)。

土壤中游离的微生物较少，但这有助于微生物的扩散。当特定表面位点的营养物被消耗时，微生物需要分布到新的位点，并在新的位点得到新的营养并形成菌落。真菌通过从子实体释放出来的孢子传播，或者通过菌丝的延伸而得以散布。细菌通过简单的细胞分裂，释放出新形成的子细胞。

2.微生物在土壤中的代谢状态

由于土壤中可利用营养易于被代谢而耗尽，因此总体上说土壤中大部分微生物处于饥饿的条件下，并且受到多种因素的影响。首先是低营养物含量的影响，在许多生境中极端低量可利用有机碳仅能支持非常低的微生物活性，此外土壤中湿度、温度的巨大变化以及进入土壤的有机或无机污染物也对微生物的代谢状态产生严重影响。营养缺乏和严峻的物理化学环境使土壤微生物在大部分时间里丧失代谢活性或仅有低的代谢活性，甚至造成微生物的形态圆化(rounding)，不平衡生长，亚致死性伤害，直至死亡。土壤环境条件的压迫不利于微生物对有机物的降解，但却可加速进入土壤病原体的死亡。但当新鲜底物被加到土壤或一种特定微生物能利用先前不能利用的底物时会表现出很高的代谢活性。前一种情况如植物废弃物被掘洞动物或昆虫带入土壤而被发酵性微生物降解。后一种情况的例子是微生物发生遗传突变或基因转移而导入一种新酶系统的表达，使先前不能降解的底物被降解。同样当一种特异降解性被导入或加入到土壤环境时，降解特定物质或污染物也可以获得高速的代谢活性，但导入微生物要有一个特殊生态位加以利用，才能与土生微生物竞争，适应土壤环境。

3.微生物在土壤中的活性

(1)微生物在表土形成中的作用

土壤形成是一个漫长的过程，包括物理、化学风化和生物作用。微生物在表土凝聚形成和稳定中特别重要。微生物从两个方面参与土壤结构的形成，生长在土壤颗粒表面上的微生物，特别是丝状微生物通过其网状菌丝体把相邻颗粒联结在一起，黏土颗粒被重新排列，颗粒之间被挤压，从而形成凝聚性能良好的土壤颗粒。另外微生物通过其产生的胞外多糖，把许多固体颗粒黏聚在一起，形成良好凝聚土壤结构。

(2)微生物在营养物循环及消除污染中的作用

有证据表明微生物最早出现在36亿年以前，那时地球大气层温度较现在要高，而且不含氧气。光合微生物进化和形成产氧能力使氧气积累在大气中，2亿年前这种氧的积累导致使大气从还原性变成氧化性(含氧)。光合微生物(自养)的进化和后来的植物进化提供了碳固定的原理和可再生的以碳为基础的能源资源。另外氧积累使大气产生了臭氧层，臭氧层减少紫外线对地球的照射量，从而保护了地球上的生物。依赖于微生物和更高的生命形式，今天碳、氧、氮、磷和铁等元素的产生和消耗之间达到微妙的平衡。在这些元素的循环中微生物起重要作用(参见第四章)。此外土壤中的微生物通过生物修复消除污染，以及在处理城市废弃物中发挥重要作用(参见第九章)。

4.微生物在土壤中的分布

土壤中存在着种类丰富的微生物，仅细菌就有10 000多种，此外还有大量的真菌、藻类和原生动物。但它们仅构成大部分土壤中总有机碳的小部分和土壤体积的非常小的部分。

(1)表土中的微生物

表土中的微生物种类有细菌(含放线菌)、真菌、藻类和原生动物，还有病毒(含噬菌体)存在。它们大多是土生群体。作为生物调控因子、生物降解因子而接入土壤的细菌，随污泥以及动物粪便带入的微生物，不论其来源如何，一般情况下只能在特定生态位发生作用，而不会对土壤微生物的丰富度和分布产生重要影响。

①细菌从数量上说细菌是表土中最丰富的微生物，可培养细菌数量达每克土壤10⁷～10⁸细胞，总群体(包括活但不能培养细菌)可超过每克土壤10¹⁰细胞。在不饱和土壤中，好氧菌在数量上通常超过厌氧菌2到3个数量级。厌氧群体随土壤深度增加而增加，但难以成为优势。土壤放线菌具有相当的数量，一般比总细菌群体(含放线菌)少1至2个数量级。它们在降解昆虫和植物多聚物(如几丁质、纤维素和半纤维素)方面具有优势。

根据生长特色和对碳基质的亲和力，土壤细菌还可以被分为K选择生物和R选择生物二类。土著细菌利用慢慢释放到土壤中的有机物作为底物，代谢速度慢，成为K选择生物;发酵性的细菌在缺乏营养时呈休眠状态，而在向土壤加入大量新鲜可利用底物以后又能快速生长，成为R选择生物。

目前研究证明土壤细菌(含不可培养)约有10 000种。而所进行的研究工作主要放在可培养细菌。可培养土壤细菌的优势属有节杆菌属(达到可培养土壤细菌的40%)、链球菌属(达到可培养细菌的5%～20%)、假单胞菌属(达到可培养细菌的10%～20%)和芽孢杆菌属(达到可培养土壤细菌的2%～10%)。重要的自养土壤细菌有亚硝化单胞菌属、硝化杆菌属、硫杆菌属、反硝化硫杆菌和氧化亚铁硫杆菌。表1-3列出了重要的异养土壤细菌的代表属种。

表1-3　　　　　　　　　　重要异养土壤细菌的代表属种

②真菌表土中含有丰富的丝状真菌，其数量范围通常为10⁵～10⁶细胞(每克土壤)，尽管数量上低于细菌，但却占土壤中微生物量的大部分(表1-4)。丝状真菌以其菌丝把土壤颗粒物理锚住，因此大多集中分布于土壤凝聚颗粒之间。土壤酵母的数量较少，一般每克土壤达到10³细胞。真菌群体在表土的O和A层数量最多，随土壤深度增加，其数量迅速减少。

表1-4　　　　　典型温带草地土壤生物群的各个主要成分生物量的大致范围

土壤真菌在营养物循环，特别在有机物的降解中起重要作用。其分解作用在酸性环境中尤为重要，在干燥、低pH值的环境中，真菌可以占优势。土壤真菌除在降解植物多聚物(如纤维素和木质素)中起关键作用，某些真菌在降解污染物中也起重要作用，如白腐真菌的原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium)对难降解污染物具有很强的降解能力。其他真菌如镰孢菌(Fusariumspp.)、腐霉菌(pythiumspp.)和丝核菌(Rhizoctonia spp.)是重要的植物病原菌。菌根真菌和植物根建立的菌根共生体对植物在恶劣环境下生长具有重要作用(参见第七章)。

③藻类光合藻类的存活和代谢需要光能源和CO₂作为碳源，因而藻类存在于土壤表面太阳光能穿透的地方，一般在10cm土壤数量最高，每克土壤的数量范围在5 000～10 000个细胞，在某些特别适合的条件下藻类大量生长时其数量达每克土数亿个藻类细胞。然而由于某些藻类能异养生长，我们在深1米的地方也能发现藻类。土壤藻类还有季节性变化，春秋比冬夏的数量多，这是由于夏天高温干燥、冬天寒冷影响藻类生长。常见于土壤的藻类有四个主要类群，绿藻(如衣藻属)在酸性土壤最为常见;硅藻(如舟形藻属)主要见于中性和碱性土壤;黄绿藻(如气球藻属)和红藻(如Probhyridium)较为少见。蓝藻(蓝细菌)的数量也较多，特别由于某些种具有固氮能力而增加对土壤氮的供应。在温带土壤中主要藻类类群的相对丰富度有下列顺序，绿藻＞硅藻＞蓝细菌＞黄细菌＞黄绿藻，在热带土壤中蓝藻占优势。

藻类在贫瘠的火山、岩石和荒漠土壤表面大量生长时对土壤的形成和提高土壤肥力有重要作用。其一是藻类通过光合作用提供了碳的输入，代谢过程中产生和释放出碳酸有助于对周围矿物质颗粒的风化。有些藻类的固N作用更为环境输入重要的N源。其二是藻类产生的大量的胞外多糖，有助于土壤颗粒的凝集，形成良好的土壤结构。

④原生动物大部分原生动物是异养的，靠捕食细菌、酵母、真菌和藻类而存活生长。由于较大的体积和需要大量的微生物作为食物来源，因此原生动物主要见于10～20cm的土壤上层，而且主要集中在有大量细菌的植物根的附近。土生原生动物有三个主要类群，包括鞭毛虫类(flagellates)、变形虫(amoebae)和纤毛虫类(ciliates)，其数量从30000个/g土(非农业温带地区土壤)、350 000个/g土(玉米地)到1.6×10⁶/g土(亚热带地区土壤)。土生原生动物的机体比其他原生动物更加柔韧，这使土生原生动物易于在有一层水膜的土壤颗粒表面以及土壤的小孔洞中运动。原生动物除捕食微生物有助土壤的能量流动外，还一定程度上参与土壤有机物的分解。

(2)表土下浅土层中的微生物

表土下浅土层中的微生物尽管在数量及多样性方面低于表土，但实际上仍存在大量的微生物，大部分是细菌，也存在真菌和原生动物。直接计数测定总细菌范围为10⁵～10⁷细胞/ g土(表土范围10⁹～10¹⁰细胞/g土)。这与有机物、无机物营养的低量直接相关。这个土层中的真核生物数也比表土中数量少几个数量级，造成这种差异的原因除有机物浓度低外，更重要的是下层土壤小孔洞，对生物的物理过滤作用。原核和真核生物在沙质沉积物中的数量比黏土区要高，黏土基质的小孔对微生物具有排斥和物理过滤作用。

可培养细菌数的计数结果比直接计数有更大的变化性，其范围从极少到接近于直接计数的数量。总体上表土下土层直接计数和可培养计数之间的差异要比表土大。下述二点可以对这种结果做出解释，一是表土下土层的营养物含量更低，微生物群体中的大部分属于不可培养的状态。另外虽然知道使用稀释营养培养基培养贫营养菌要比丰富培养基好，但使用的稀释营养培养基的类型仍然不完全合适。

表土下浅土层微生物的类型多样，优势类群是好气异养细菌，但也有少量的厌氧和自养细菌以及真核生物。优势微生物种类随土层深度变化而变化，它们在生理上不同于表土微生物，罕见分裂。含有少量的核糖体或包涵体。它们能降解简单的基质(如葡萄糖)以及更复杂的化合物(如环状化合物、表活剂和农药)。它们也能很快适应高营养，在丰富培养基上生长，说明它们也能代谢各类有机化合物。这些特征表明它们能原位清除进入的各类有机污染物。

(3)表土下深土层中的微生物

表土下深土层是一种极端贫营养的环境，在这种环境中存在极少的微生物。微生物学家从地表下数百米油沉积物水层中分离到硫盐还原菌。有人认为它们是300亿年前开始形成石油被埋在那里生物的后代。

(4)深渗滤层中的微生物

研究证明渗滤层中含有少量的微生物，一般微生物数量和活性在古土壤(paleosols)中较高。古土壤是曾经在地球表面的土壤-植物系统。渗滤区含有的微生物对经过渗滤区的环境污染物具有降解作用。

(5)深饱和层土壤中的微生物

饱和层中也存在种类繁多的微生物。科学家对从饱和层土壤中取得的岩芯(近500米深处的7亿到13.5亿年内的白垩纪沉积物)分析表明样品中存在多样和大量的微生物群体，总数范围为10⁶～10⁷细胞/克沉积物。检测到的微生物包括好氧和兼性厌氧化能异养微生物、反硝化菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌、硫氧化菌、硝化菌和固氮细菌，还有少量蓝细菌、真菌和原生动物。从样品分离出来的细菌具有多样的代谢能力，不但能代谢简单的糖、有机酸，也能分解复杂多聚物(如细菌储藏产物β-羟基丁酸，表面活性剂如吐温40、吐温80)。

5.土壤中微生物的生理、遗传特点

(1)土壤中存在数量巨大的活的不可培养微生物

土壤微生物的计数有间接计数和直接计数。间接计数反映的是可培养微生物(culturable microbes)的数量，直接计数反映的是可培养微生物和活的不可培养微生物(viable butmonculturable microbes)之和。表土中微生物直接计数的结果一般高出间接计数1～2个数量级，在其他土壤层中这个差异还要大，造成这种巨大差异的原因是土壤中存在大量活的但不可培养微生物，一般认为土壤微生物的99%可能是不可培养的。土壤环境条件恶劣，营养贫乏致使大部分土壤微生物亚死亡损伤，受损细菌有非常特殊的营养需要，不能用常规的方法进行培养。由此我们知道目前的研究方法所了解的实际上是这个群体的一个非常小的部分。活的但不可培养的微生物对环境微生物是十分重要的，其一是活的但不可培养病原菌仍能感染和造成疾病，其二许多活的但不可培养微生物是不能被忽视的。

(2)土壤微生物与生境的统一

土壤环境和微生物的长期相互适应使任何一个特定的土壤或生境会产生一个相应的微生物群落，在群落中有丰富的微生物多样性，这是两个方面作用的结果，一方面是特定生境和生态位对微生物的选择，另一方面是微生物对生境和生态位的竞争，确保微生物的“最适的存活”。

(3)不同土层中微生物的同源性

微生物学家对从饱和层土壤样品中分离出来的好氧菌作16S rRNA基因序列的系统发育分析，得到一个分类鉴定结果(表1-5)。把饱和层中的细菌属和表土中细菌属(本节二、4(1))比较，可以看到很多共同的属，这说明表土中的细菌和饱和层细菌相类似，也可以说整个土壤细菌同源、组成类似。

表1-5饱和层中分离的好氧化能异养菌的16S rRNA基因序列系统发育分析的分类鉴定结果

续表

6.影响土壤微生物数量、分布、活性的因素

土壤微生物生长要依赖于营养元素(C、N、P等)，在土壤环境中只有有机物，特别是腐殖质能为微生物提供长远和稳定的营养物。因此微生物数量常会随土壤有机物含量的增加而增加。在植物根际，根的脱落组织和释放出来的植物代谢物聚集使那里有机物浓度相对较高，微生物数量也相应较多。

土壤溶液也对土壤微生物的数量活性产生重要影响。微生物含大约70%水，微生物代谢需要高水活度。土壤溶液中的有机和无机物质为微生物提供营养物。土壤微生物一般被包围在土壤的水膜中，在水膜中微生物易于取得营养物和把废弃物排放到水膜中，同时也有利于微生物对土壤颗粒的吸附。土壤孔隙中不完全充满的水易被好氧微生物的利用，有利于这部分微生物的生长。当孔隙中水完全充满时，由于氧中扩散较慢，可利用的溶解氧会被全部利用，氧化还原电位降低。这时厌氧微生物就会取代好氧微生物。

微生物附着也受到功能基团的控制。虽然黏土表面和微生物表面带有净负电荷，但黏土表面由于土壤溶液中的正电荷离子(如K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺和Al³⁺)的积累而被中和。正负表面电荷结合在一起被称为电偶层(double layer)。通过阳离子桥使细菌被吸附(图1-3)。另一方面微生物的负电荷也可以与正电荷形成电偶层。电偶层的厚度取决于土壤溶液中的离子的化学价和浓度。高价和增加离子浓度将拉紧电偶层。由于黏土颗粒和细胞的电偶层相互排斥，黏土和细胞表面之间的层越薄，排斥力就越小。当排斥力减小时，静电力和范得华力这样的吸附力使微生物细胞被吸附到黏土表面。此外微生物表面附属物固着器或菌毛的作用或胞外多糖等黏胶物质的产生，促进了土壤颗粒对微生物的吸附作用。这样大部分微生物都被吸附于黏土表面，而不是游离于土壤溶液中。

pH值也是制约土壤中微生物数量活性的重要因素。高酸、高碱条件可抑制许多微生物的生长。在低pH值土壤中真菌是占优势的群体，而在高pH值环境中细菌会占优势。向酸性土壤投加石灰可使土壤碱化，而投加硫粉则使土壤酸化。

温度能影响酶反应速率，因而温度能控制微生物的活性。嗜温菌组成土壤细菌的大部分，真正的嗜冷、嗜热微生物仅为少部分。

图1-3　通过阳离子桥细菌细胞吸附到黏土颗粒上