降解菌及其降解基因的指示系统

七、降解菌及其降解基因的指示系统

把基因产物易于检测的报道基因(reporter genes)连锁到需要指示的降解基因的启动子上或整合到降解微生物的染色体(或质粒)上就可以构成降解基因的指示系统。利用这种指示系统，通过对基因表达的检出来评估降解基因及微生物的活性。这种系统依据的原理是大多数基因编码的产物及其活性不易检出，而一些可以作为报道基因的产物及活性却易于检出和定量测定。把报道基因连锁到降解基因或插入到降解微生物的载体上表达就可以检测到降解微生物的降解活性。报道基因的基本要求是易于检测，高度灵敏，可定量并能稳定表达(表8-9)。

表8-9　　　　　　　　　　环境微生物中有用报道基因的特征

目前已经有多种基因被认定为可作为报道基因，主要包括代谢糖基因及发光基因，计有lacZ、gusA、xylE、luxL、lux(DABE)基因以及绿荧光蛋白(GFP)基因。

lacZ基因:基因编码β-半乳糖苷酶，它能把乳糖这种二糖切割成葡萄糖和半乳糖。在补加x-Gal的琼脂上生长的菌落产生蓝色，对其进行比色分析可定量分析β-半乳糖苷酶的切割产物，此外也可用荧光和化学发光试验来定量分析活性。但样品必须至少含有10⁵～10⁶个细胞才能定量分析。由于易于检出和有多种载体进行融合，lacZ是细菌培养物中基因调节研究的最常用的报道基因。

gusA基因:这种源于大肠杆菌的葡萄糖醛酸酶基因也是一种非常有用的标记，因为这种酶有许多荧光底物，而且从环境中分离出来的细菌很少能产生这种酶。许多底物被降解时能产生荧光，如5-溴-4氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸。gusA基因融合已广泛用于研究病毒性植物病原体、植物和真菌的基因表达，所有这些有机体缺少固有的β-D葡萄糖醛酸酶活性。这些条件使少到单个细胞的gus活性都能灵敏地测定。

xylE基因:xylE基因来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的(降解)甲苯(TOL)质粒，编码儿茶酚2，3-双加氧酶。这种酶能把邻苯二酚转化成2-羟基黏康半醛，产生一种黄色色素，可用分光光度法测定。这个基因在没有接触过芳香烃污染物的微生物中很少见，使它有助于基因表达的系统的原位测试，已成功用于多种革兰氏阴性细菌。

发光报道基因在指示系统中的应用极为普遍，主要有lux和绿色荧光蛋白标记。

lux(lux CDABE)基因:这种基因编码荧光素酶及反应过程中的醛底物，luxAB编码活性荧光素酶，而luxCDE编码醛的合成酶。荧光素酶在作用底物荧光素时会发出荧光。把lux基因插入被研究的操纵子中，在那个操纵子被诱导时就会发光。这种基因在土生微生物中是极不常见的，因此已被广泛使用。大多数lux系统需要每个样品中含约10⁵个细胞才能对发光进行检出，这种检出以一种不毁结构的方式直接进行，发出的光通常用闪烁计数器的单光子计数方式进行定量分析。这种基因在评估基因表达方面极为有用，并且已经用于评估异生物源有机物(如萘)生物降解。lux系统的应用还在不断扩展，光纤维埋进土壤可以用来指示微生物对土柱中污染物降解的原位反应。

GFP标记系统(绿色荧光蛋白标记系统):GFP基因见于维多利亚多管水母(Aequorea victoria)。GFP自身能把这种水母的蓝色生物发光转变成绿色，其原因还不清楚。当GFP基因在细胞(真核或原核的)中表达时，形成环状结构。紫外光(395nm)激发GFP会产生亮绿色荧光(509nm)，这种亮绿色荧光可被测定，也可以作为细胞存在和数量的指标。与上述的lux系统相比，因为单个细胞中就有充足的GFP，所以可以测定单个细胞的基因转录而不是集群细胞的转录。同时GFP荧光不需要细胞代谢，因此并不活跃生长的细胞也能表达，这可能是许多环境中的实际情况。另外GFP和lux之间还有一个重要的差别，lux表达一停止发光就会停止，而GFP蛋白只要保持完整就会继续发光。这种lux是一个比较可靠的实时的活性指示基因。