降解质粒与降解过程

三、降解质粒与降解过程

部分带有降解质粒的细菌对其底物的降解途径以及质粒编码的酶在降解中的作用被深入进行了研究。位于质粒上的降解基因编码的酶催化降解过程的前期反应，降解过程的中间产物又可被染色体上基因编码的酶进一步降解。从这些降解过程中，我们可以看到微生物降解质粒在生物降解中的重要作用。

质粒的降解底物非常多样，大多数污染物特别是难降解污染物的生物降解都有质粒的参与和起作用。下面以萘、甲苯和2，4-D的降解为例说明质粒的重要作用。

1.萘的降解

恶臭假单胞菌PPG7的NAH7质粒中基因编码酶降解萘途径如图8-5。萘通过不同的途径进入环境，从环境中已分离出许多降解萘的微生物，携带NAH7质粒的恶臭假单胞菌PPG7对萘的降解性具有代表性。质粒中的降解基因组成两个操纵子。上游操纵子编码把萘转化成水杨酸盐的酶，而下游操纵子编码的酶把水杨酸盐转化成TCA循环的中间代谢产物。多组分的萘加双氧酶催化上游途径中的第一步反应，把分子氧插入1，2位双键的两边。萘加双氧酶由4个亚基组成，酶由nahA基因簇中nahAa、Ab、Ac和Ad分别编码。反应产物是顺-dihydroldiol萘。这种化合物的羟化环被dihydrodiol脱氢酶(NahB)再芳香化(rearomatized)，导致失去两个质子。1，2-二羟萘双加氧酶(Nahc)加入分子氧断开羟化环的双键。这种环断开产物自发异构化成为2-羟基苯并吡喃-2-羟酸盐。2-羟基苯并吡喃-2-羧酸盐异构酶(NahD)催化二次异构化得到2-羟基苯基丙酮酸盐。这种分子被具有水解酶和醛缩酶功能的同一种酶(NahE)水解断开烷烃侧链，而后再被氧化，反应产物是水杨醛，水杨醛被氧化酶(NahF)进一步氧成水杨酸盐。

图8-5　 NAH7质粒上基因控制的萘降解途径

下游途径的第一步是水杨酸盐水解酶(NahG)催化水杨酸盐单加氧氧化形成儿茶酚，儿茶酚氧化的第一步是环的间位断开，nahH编码的儿茶酚-2，2-双加氧酶催化这一反应，把分子氧加到邻接一个羟基的双键两端。这种间位断开不同于邻位断开(邻位在2，4-D的降解中见到)。产物2-羟基黏康半醛能被进一步代谢，通过水解去除aldehyde基团(NahN)得到2-氧-4-戊烯酸盐。另一途径是aldehyde首先被氧化成2-羟基黏康酸盐(NahI)，而后又被tautomerized成4-草巴豆酸酯(NahJ)，其后在草巴豆酸酯脱羟酶(NahK)作用下也得到2-氧-4-羟戊烯酸盐。其后在2-氧-4-戊烯酸盐水解酶(NahL)水解作用下产生2-氧-4-羟戊烯酸盐。最后这种分子被染色体基因编码的醛缩酶打断得到丙酮酸和醛，两者都进入TCA循环。

在本降解过程中编码间位断开途径的基因是水杨酸操纵子的部分，而实际上儿茶酚的降解情况是复杂多样的，一般能降解芳香化合物的微生物都能代谢儿茶酚。编码儿茶酚降解的基因已被定位在某些生物的染色体上，有的定位在质粒上，而某些生物可以把拷贝同时定位在染色体和质粒上。

2.甲苯的降解

pWWO(TOL)质粒不但能降解甲苯，也能降解m-和P-二甲苯(m-和P-xylene)和其他苯衍生物。质粒的结构如图8-6所示，编码降解酶的操纵子被命名为xy1。基因由两个操纵子组成，两个操纵子涉及上游(upper)和下游(lower)间位裂解途径。它们编码的酶列

图8-6　 pWWO(TOL)质粒图

如表8-4所示，xy1CAB编码的酶把甲苯降解成苯甲酸，而xylXYZIEGFJKIH编码的酶把苯甲酸降解成乙醛和丙酮酸。携带pWWO质粒的恶臭假单胞菌mt-2菌株降解甲苯途径如图8-7所示。

图8-7　 pWWO质粒编码酶主导的甲苯降解上游途径

表8-4　　　　　　　　　　 pWWO(TOL)质粒基因编码的酶和调控蛋白

3.2，4-D的降解

能降解2，4-D的真养产碱菌菌株JMP134(A.eutrophus JMP134)的2，4-D降解质粒PJP4是被广泛深入研究的具有代表性的质粒。这种质粒广宿主范围(broud host-range plasmid)，大小78kb，能自主转移(self-transmissible)。6个结构基因(tfdA、tfdB、tfdC、tfdD、tfdE和tfdF)和两个调控基因(tfdR和tfdS)参与降解过程。六个结构基因组成3个操纵子fdA、tfdB和tfdCDEF，编码6种降解酶，把2，4-D降解转化成β-氧代己二酸。这个最后产物成为染色体编码的己二酸途径的底物，最后得到琥珀酸和乙酸盐进入TCA循环。质粒编码酶对2，4-D的降解途径如图8-8所示。

4.质粒的水平转移

上述的例子说明质粒编码的酶参与单一一步到复杂的多步途径，质粒以多种方式使微生物得到代谢能力来开发不能利用的资源。把质粒携带菌株接种到环境中，质粒中的遗传信息还可以转移到土著微生物中。这种类型的遗传交换(称为水平转移)使降解基因具有高水平的同源性，而亲缘关系很疏远的微生物能转化同样的底物。

5.降解基因的同源性与差异

虽然许多降解基因之间有很高的同源性，但DNA的序列和某些更复杂途径的调节控制也存在明显的差异。clc(pAC25质粒)、tcb(PP51质粒)和tfd(质粒pJP4)操纵子的比较研究可以说明，这三种操纵子都编码一种调控蛋白和降解氯代儿茶酚的酶，都有高水平的同源性。然而一定序列的差异已经改变调控蛋白的专一性。clc和tcb以及clc和tfd途径的调控蛋白可以互换，然而tcb和tfd的调控蛋白不能互相替代。这说明这些基因可以有相同的起源，但出现差异，这可能是进化过程和一些其他选择压力所产生的突变积累的结果。

图8-8　真养产碱菌(PJP4质粒)降解2，4-D的途径