生物降解性测定

生物降解性测定_环境微生物学（上

一、生物降解性测定

1.测定方法

研究生物降解性的最根本的目的是依据生物降解的测定结果指示污染物的生物降解性，评估含污染物污水、废弃物生物处理的可行性和修复潜力以及它们在环境中的残留及生态风险。环境污染物的生物降解是一个十分复杂的过程，研究者可以按需要选择不同的终点，采用不同的方法来测定环境污染物的生物降解性。

(1)生物降解性测定的要素及表征

测定一种化合物的生物降解性，构建实际测定系统除了要有目标化合物外，必须充分考虑四个方面的要素:①降解微生物及其对污染物的可接受性，接种微生物可以有单种、菌群及混合菌群，微生物可以是专一性降解菌、适应驯化菌，以及污水处理厂污泥、污染环境微生物菌群、生态环境中微生物群聚生境(如底泥、土壤等)的微生物源。②降解系统的组成，从单一污染物加上其他营养物的培养液、污染物加环境样品模拟系统到微宇宙、中宇宙，甚至原位测定的野外现场调查。③检测终点，包括母体化合物的消失、矿化产物的产生(如CO₂、NO₃^－、CH₄等)、电子受体的消耗(如O₂、NO₃^－等)、挥发性物质产生、能量产生(如ATP)、生物量增加、降解酶活性、生物毒性(母体化合物及中间代谢产物的毒性)等。④实际测定的环境条件，如pH值、温度、大气压、水活度、静态、动态等。

表征生物降解性的数据包括一级或二级速率常数、半氏常数、生物降解比速率(每克初始微生物，每小时对基质的去除数量)、达到标准化合物同样生物降解程度所需时间、BOD在理论需氧量中的比例、降解半衰期等。

(2)生物降解性测定的方法

任何生物降解系统都是目标化合物和上述四种要素的组合，一般来说都是一种模拟试验。因此实际测试中我们应根据研究目标设定不同研究方法。目前对测试方法的分类及命名都不甚统一，一般都是在满足其他条件下从某一角度出发设定具体的测定方法。

1)基于降解系统组成的测定方法。从降解微生物选择及降解环境系统来说有微生物方法和环境学方法。微生物学方法:其通常使用纯培养在最适条件下研究化合物的降解，然而其条件是自然环境所没有的，因此其结果不能直接预测它们在环境中的实际行为，降解性通常被高估，但对进行生物处理仍有重要参考价值。但使用的不同微生物接种物如在数量、驯化、纯培养、混合菌群、菌群等方面的差异可以得到不同的结果。环境学方法:其着眼于化合物在受污染水体和土壤中的降解性，通常使用取自污染区域或废水处理厂的混合微生物源或模拟自然条件下培养于实验室的混合微生物培养物来进行实验研究，对所得结果的评价更接近于野外的实际情况。模拟条件的不同情况使环境学方法实际上是极其多样的。

2)基于终点的测定方法。选择不同的测定终点也代表不同的方法，常用的有母体化合物的消失、O₂消耗测定、CO₂产生测定、活性污泥挥发性物质产生测定、酶活力测定、ATP量测定、总有机碳测定等。

①母体化合物的消失测定。母体化合物的消失是生物降解和生物转化的最具体最直接证据，对许多难降解环境污染物的生物降解性大多以母体化合物的消失作为表征，这是因为难降解污染物最初(或是第一步)的降解是极为关键的，开始的降解可以带动整个降解过程。这种方法也有其不足，母体化合物的消失并不等同于完全降解，还要考虑到中间代谢产物的抗降解、积累及毒性等问题。

②氧消耗测定。O₂是好氧生物降解的电子受体，生物降解过程伴随着O₂的消耗和CO₂的产生，BOD测定就是建立在这种理论基础上。通过O₂的消耗来判定生物降解性是一种十分科学的方法。O₂消耗主要用华氏呼吸仪或电化学方法测定。通过测定氧的消耗测定基质的可生物氧化率、基质的生化呼吸曲线。

基质的可生物氧化率测定:基质的可生物氧化率测定以微生物作用下分解特定污染物的耗氧量为分子，完全彻底氧化所消耗的理论需氧量为分母，二者的比值即为基质的氧化率。

氧化率是可降解性的一种指标，氧化率越大，基质的可生物降解性越高。

这种方法在实际的应用中可以用COD或TOD替代完全氧化的需要量，以BOD₅替代实际耗氧量，以BOD₅/COD/或BOD₅/TOD比值可评定其降解性。比值越大，说明该物质越易生物降解。据国内外有关研究报道，基质氧化率和生物降解性的关系如表8-11所示。

表8-11　　　　　　　　　　氧化率与生物降解性

基质的生化呼吸曲线测定:测定基质降解过程中的耗氧量，以时间为横坐标，耗氧量为纵坐标，即可绘制出基质的生化呼吸曲线，亦称耗氧曲线。当微生物处于内源呼吸阶段(即利用自身细胞物质作为呼吸基质)时，其呼吸速度是恒定的。耗氧量与时间成直线关系，这条线被称为内源呼吸线。当供给微生物有机营养时，耗氧量随时间的变化是一条特征曲线，称为生化呼吸线。为评价基质的可生物降解性，常将基质的生化呼吸曲线与内源呼吸线进行比较。该比较可以出现如图8-38所示的三种情况。

③脱氢酶活性测定。降解酶在生物降解中起重要作用。脱氢过程在微生物氧化分解有机物中起重要作用。有机物的生物降解性能可以从脱氢酶的活性上明显反映出来。脱氢酶对毒物尤其敏感，它的活力下降往往与毒物的侵袭有关。因此，测定脱氢酶的活性也是进行有机物生物降解研究的常用方法之一。

图8-38　微生物呼吸线与内源呼吸线的比较

a.生化呼吸曲线位于内源呼吸线之上，说明该有机物可被微生物氧化降解，两条呼吸线之间距离越大，说明该化合物降解性越好。b.两条线基本重合:说明该有机物不能被微生物氧化分解，因为虽然投加了基质，微生物所进行的仍只是内源呼吸，但它对微生物的生命活动亦无抑制作用。c.生化呼吸曲线位于内源呼吸线之下:说明该有机物不仅难以生物降解，而且对微生物产生明显的毒害(或抑制)作用。生化呼吸曲线越接近横坐标，表明毒害越大。

④ATP量测定。三磷酸腺苷(ATP)是生物体内一种高能的磷酸化合物，它在能量的贮存和转换中起着重要的作用。测定ATP的含量，不仅可以反映生物的活性，而且还能反映活性生物量的多少。目前已有快速测定ATP量的精密仪器，故这一方法已越来越引起人们的注意。

⑤总有机碳(TOC)测定。取一定量样品经微生物作用，然后测定作用前后试样中总有机碳的变化，以此来评定被测有机物样品的生物可降解性。有机物所含有的总碳量叫做TOC(total organic carbon)。水中的碳除了包含于有机物中外，还存在于碳酸、重碳酸中。因此，由总碳量TC(total carbon)减去无机碳TIC(total inorganic carbon)便可求出TOC。测定时把微量水样通过温度达到950℃的燃烧炉，使水样中的有机碳和无机碳全部氧化，生成CO₂后用紫外线气体分析仪测出;与此同时，将另一份同样的水样在150℃左右的温度下，使无机碳化物氧化，生成CO₂并测定之，二者之差即为TOC。

因为有机物的生物降解也可看做是含碳有机物物质的无机化和转变为细胞物质的过程。所以只要掌握好一定的活性污泥和时间等条件，所得到的检测试样中总有机碳的变化值，便可用来表示相应有机物的可生物降解的程度。

⑥CO₂产生量测定。有机碳化合物完全矿化降解的最终产物是CO₂，测定降解过程中CO₂的产生量是对生物降解中有机物转化成CO₂程度的最好指标，尤其适于监测混合有机物的降解过程。同时CO₂收集和测定简便精确，因此测定CO₂来监测生物降解过程特别重要，例如监测堆肥过程中CO₂的产生量可以有效指示处理过程及效率。

⑦活性污泥中挥发性物质测定。活性污泥中的挥发性物质，是活性污泥中具有生物活性的部分。因此，活性污泥中挥发性物质含量的多少，可反映一定条件下生物活性的强弱。生物活性可间接表示基质的生物降解性能，因而假如其他条件保持恒定，仅仅改变待测物质的种类或浓度，那么经过一定时间后测定活性污泥中挥发性物质的含量，所得数据应与有机物的生物可降解性有关。

⑧专一性14CO₂测定。收集测定14C标记有机污染物生物降解放出的14CO₂，并以此评价这些有机污染物的生物降解性具有科学、特异和精确的特点，是生物降解测定中首推的方法。这种试验分批进行，放射性标记试验化合物和实际的环境样品一起培养，监测放射性产生能力。这种专一性使我们能测出一种化合物的真实浓度，证明生物降解的完全性，以及实际的动力学过程。这种方法已被用于活性污泥、河流河口、海洋水体、淡水和海洋沉积物、地下水和表层及表层下土壤降解。这种试验方法有许多优点，首先其易于测定，CO₂易于吸收在碱性溶液中，也易于通过液体闪烁计(LSC liquid scintillation counting)定量测定。这种方法也有某些限制，用CO₂作为唯一的终点，只能确定化合物经历矿化以后的归宿，不是矿化而是转化的化合物有较少的应用，而且有时也不与母体化合物的消失相适应，此外化合物及其代谢产物被综合到生物量或自然腐殖质材料中而造成在某些系统中的低回收使得某些物质的归宿带有不确定性。这种低回收的情况难以测定单个化合物在复合物中的生物降解程度及存在的代谢产物，而且这种唯一一种终点分析使我们对降解原理的理解不足。

3)基于有机物降解难易的测定

①易于生物降解化合物的降解试验。易生物降解物质应满足下列条件:

a.它们能作为微生物的唯一碳源与能源。

b.它们能完全矿化成CO₂和水。

c.它们不需要任何复杂的适应和选择的微生物降解菌。

d.它们的降解速率和存在于污水中的有机物相应。

e.降解快速进行，且不出现不希望的环境效应。

模拟自然条件用相应浓度的基质和仅部分适应的微生物，当试验已经证明易于生物降解时，则能确实地假设这种化合物在自然条件下也易于生物降解，不需要进一步试验。试验通常包括BOD分析和CO₂产生来决定TOC的失去。但阴性结果不一定说明这种化合物在各种环境条件下是抗降解的。

②潜在生物降解性化合物潜在降解性测定。其目的是决定是否降解是基本可能的。潜在降解性试验一定程度上模拟生物污水处理厂和自然条件，维持一定的条件，为微生物降解提供基本条件。在这种条件下不能充分达到希望降解程度的化合物被定为难降解的(poorly biodegradable)。这些条件的限定是非常重要的，分类为难降解的基质的降解在环境中已被证明很大程度上依赖于具有长世代时间的微生物。用生物柱和生物膜反应器进行实验倾向于能富集更长世代的微生物。这就是说降解基质时要用选择的微生物，使用常用的污水处理过程的降解试验不能说明易于生物降解。

③厌氧条件下的生物降解试验。大部分有机物在好氧条件下更好转化，但有些化合物在厌氧条件下能更快降解。例如许多卤代化合物(特别是多氯联苯等氯代化合物)在厌氧条件下能更好脱氯。厌氧生物降解性评价有特别重要性，因为污水处理中污泥的修复在厌氧条件下进行，某些工业污水在厌氧过程中成功处理，在自然条件下，厌氧降解可以发生在河流、湖泊沉积物下层及地下水的深水层。厌氧过程在试验类型中应有其重要地位，特别是那些在好氧条件下具有抗性的化合物。

④降解试验层次性方法。首先进行易生物降解试验，但一个单独的试验的正和负的结果对基质的降解性评价是不充分的，要多种试验并行，通常包括结合BOD分析和CO₂产生来决定DOC失去。如果两种试验证明易于生物降解，这种试验即告完成。如果试验结果是阴性的，接下来进行潜在生物降解性试验。如试验仍达不到希望的降解性程度，基质被定为难降解的(poorly biodegradable、resistant biodegradable)。一般来说使用特殊的试验方法，即要选择微生物和较不普遍的污水处理过程，则化合物不能认定为易于生物降解。如果需要，研究工作的下一步是对降解微生物进一步研究。

现存的许多生物降解试验方法主要存在的问题是不模拟野外的实际情况，局限于选择的终点，所确定的化合物浓度多从实验出发有利于实验而不是考虑化合物正常进入或存在于环境基质中的量。此外动力学分析常不进行，而且数据先被套入一种预先设定的模型(如一级反应)。

用不同的方法测定的化合物的降解性其总的趋势是一致的，但具体的数值因不同条件的差异有较大的差异也是正常的。

2.实验设计

(1)试验化合物的剂量和加入

实验设计对生物降解(包括实际的14C试验系统)有重要的影响。设计中的一个重要方面是化合物的剂量及如何被加到系统中。合适的剂量应是环境中的实际浓度，但试验研究中的剂量往往高于环境浓度，因此提高测试灵敏度是一个值得关注的问题。有研究者对一种与日常使用阳离子表面活性剂相对应的长链胺化合物在活性污泥中的矿化作了研究，化合物采用两种不同的处理方式(分别溶于异丙醇和20%异丙醇-水两种系统中)被注射到试验系统，结果发现矿化的差异非常明显，前者的矿化快而彻底，后者却慢而不完全，如图8-39所示。

图8-39　长链胺化合物在活性污泥中的降解时剂量的效应

一种硬脂酸被以水溶液的形式注射到土壤，其在土壤的不同组分中的矿化也充分说明矿化速率的剂量效应(图8-40)。

从图中可见其在沙中矿化最快，而在棕黄酸中矿化最慢。这些例子说明矿化速率和矿化程度高度受到化合物的剂量及被接受试验系统的影响。产生不同结果所提出的问题是什么代表真实，什么是正确的。在第一个例子中两种注入方式都不能准确代表这种化合物进入废水的方式。但这种来源于注入方法的生物降解试验敏感性说明一种化合物在环境中的物理/化学形式的关键重要性，而且需要在实验中再现这种形式。

图8-40　硬脂酸钠在土壤中矿化时剂量的效应

(2)数据处理

数据处理是实验设计中一个重要方面。现在的问题是常常没有进行动力学分析或数据被局限于事先认定的模式中，而一般都用一级反应的模式来描述生物降解和化合物的消失。有人研究过一种阳离子表面活性剂(AES，alkl ethoxylate sulfate)的生物降解，经拟合AES的初级降解可用一级衰减模型描述，AES的半衰期少于5分钟，但实际检测数据说明当模型指示没有AES的30分钟后仍存在，实际的低水平(＜1%)仍然检测到(即使在3小时后) AES。利用一种简单的一级消失模式和几分钟的半衰期会明显高估污水处理的去除。最适合的方法应是按准确测定的数据拟合出降解动力学数学模型。

3.生物降解试验方法改进

理想的生物降解试验应包括母体化合物消失的精确分析，代谢物的形成、消失及矿化。同时找到一种最合适的描述公式。改进生物降解测定方法主要包括三个方面:①增加检测的终点，包括母体化合物、代谢物和放出的CO₂。②以一种更符合实际的方式把化合物加到试验系统。③对数据进行更强有力的动力学分析以准确测定生物降解速率和找到最合适的描述生物降解过程的模式。

(1)多终点检测

增加检测的终点包括母体和代谢物的量，特别要测定综合到生物量成分(即蛋白质、脂质、核酸和细胞壁)中的量。为此发展了一系列的分析技术，包括Rad-HPLC、Rad-TLC和Rad-GC/MS以及系列抽提方式回收母体、代谢物和生物量成分。

图8-41是这种多终点的试验流程，称为die-away试验。试验的化合物培养于新近从环境中得到的样品(如活性污泥、生污水、河水、河水稀释的排放水、厌氧消化池污泥等)。氯化汞灭菌的样品作为非生物对照，这种处理作为分析母体化合物回收、各种生物量组分放射性的非专一性回收及水解、吸附在试验容器或挥发的非生物失去的对照。定期从两种处理取子样品和冻干处理，冻干固体用合适的溶剂抽提以回收类似代谢物，抽提物用LSC分析测定总的放射性，用Rad-TLC测定相关的母体和各种代谢物的丰富度。提抽后的固体被直接分析或定量转移到微离心管作生物量的生物化学分馏。分别用冷三氯乙酸抽提以回收低分子胞质成分，用醇/醚回收脂肪，热的TCA回收核酸，用10mol/L NaOH回收蛋白质。此后再以溶剂提抽并离心，并用LSC计数回收悬浮物的放射性，最后是全部抽提后固体焚烧测综合到细胞壁的量，每次分馏的数据与非生物对照比较。另外14CO₂通过酸化子样品测定，并比较两种处理的不同。放出的14CO₂用碱液回收并用LSC定量测定，溶解的14CO₂通过酸化子样品测定。吸收酸化后放出的CO₂并在碱液中测定。通过比较两种试验的差异我们可以理解化合物在环境样品中的生物降解情况。

图8-41　普通die-away试验的示意图，用于评价14C试验化合物在环境样品中的初步和最终生物降解

图8-42是这种试验设计所得数据的图形。试验说明了AES(alkyl ethoxylate sulfate)在活性污泥中的降解，试验化合物是一种14CE₃S同系物，均在1和3羟乙基上标记，注入剂量最后浓度为1mg/L。从图中可见化合物加入后化合物母体的消失立即开始并快速进行。和母体消失同时发生的是放射性被吸收到生物量中，14CO₂的放出和极性代谢物的短时间(瞬时)出现，这种代谢物被鉴定为PEG磺酸盐(polyethylene glycol sulfate)。这一结果说明AES降解是在醚键处断开导致PEG磺酸盐和脂肪醇的释放，脂肪醇其后又被矿化和综合到生物量中。经过3小时的降解，大约95%放射性从母体中放出，这等同于在生物量和14CO₂中的分配。这种分配和大约0.5的生长收获是相一致。连续试验更长的时间仅会得到生物量中的碳转化成14CO₂的数据。从这组试验数据可以看到使用矿化作为唯一的终点将会总体上高估降解母体化合物及它们初级代谢产物所需要的时间(即把短的降解时间估计长了)。

(2)受试化合物的模拟注入

试验设计中分析以外的一个重要问题是把受试化合物注入到试验系统中。对中高溶解度化合物，将其水溶液注入即可，但对大多数低水溶性和吸附性化合物则要特别注意注入方式，实际测试中一般应模拟其进入系统的方式。例如某一种洗涤剂成分进入污水的过程是其和各种其他清洁剂，特别是与表面活性剂一块被排放到下水道，然后进入污水系统。由此接种这种化合物到试验系统的最好方式是把其溶入污水中。这种方法不仅模拟化合物如何正常进入污水，也使化合物在试验系统中的均质分布，还改进了取子样品时的可替换性。

又如研究洗涤剂在土壤中降解时，先要考虑其是如何到达土壤的，大部分的洗涤剂成分是作为污泥的一部分到达土壤的，而污泥是作为土壤调理剂(amendment of soils)使用的。试验化合物接入土壤的理想方法该是把少量的污泥样品置于试验容器(test vessel)中，以溶质或水的形式直接把试验化合物加入污泥中，把土壤加到容器，并混合污泥和试验化合物到土壤，因此这种方法可更加准确模拟洗涤剂成分如何正常进入土壤，而不是注入到土壤。这是一处模拟自然过程的方法。

图8-42　AES在活性污泥中开始降解的情况

(3)数据动力学分析

对数据的动力学分析也是试验中的重要问题，已有商业出售的回归软件(Jandel Table Cwrve2D)把数据输到多重等式(multiple equations)，以进行非线性回归。实际上，每一生物降解数据系列能符合于各种衰减和利用等式。这些等式包括:零级(zero-order)、一级(first order)、统计学一级(logistic first-order)，以及firse-order with log or three-helf order with growth or three half-order without growth。最合适模式可用统计学方法作检验。图8-43说明选用最适模型的必要性。从图中可见一级(first order)和three-half order模型符合于一种AES同系物在活性污泥中初步生物降解数据。r²检验说明一级(first order)衰减模型准确描述AES的消失，实际符合(fit)的closer的检测和残留物说明3/2-order模型更加合适和准确。

图8-43　一种AES同系物在活性污泥中的初步降解:一级与3/2级模型与实际数据符合比较