慢性毒性试验的程序

三、慢性毒性试验的程序

1.实验动物

一般要求选用几种实验动物。目前常用的动物有大鼠和小鼠。最好慢性试验使用的实验动物与亚慢性试验动物相同，有利于研究的连续性。每个给药剂量组应用的动物数量各家看法不完全一致，如大鼠在40～100只，雌雄各半，不过以统计学方法处理数据可靠性为依据，则要在试验设计时做好准备。例如求化合物的慢性阈值，设计要求实验动物有5%出现某项指标改变为阈剂量的标准，使概率达到0.01时，则此剂量组至少应有90只实验动物。但如果以剂量组间及与对照组比较，某项指标呈明显的剂量—反应即可，取用的动物数则可以相应的减少些。此外，如给药不同期间设计处死部分动物作病理组织学或某些脏器的生化分析，或准备给药终止后再留部分动物作远期效应观察，则应适当增加每个剂量组的动物数。

由于慢性毒性试验期长，所选动物年龄应小。大鼠、小鼠应为初断奶者，即小鼠生后3周（体重约10～15g），大鼠生后3～4周（体重约50～70g）。

2.给药期限和条件

一般认为给药6个月或以上即可，也有学者主张动物采用终生染毒。认为终生染毒所求得的阈剂量与无作用剂量更能全面反映外源化合物的慢性毒性作用。但是，还有学者根据一些试验认为，以大鼠为实验动物慢性染毒一年以上，大鼠不一定再出现新的毒性效应。例如据报道，在122种化合物中，大鼠连续染毒3个月（90d）之后才出现毒性效应的只有3种（占2.46%），其余均在3个月内已出现毒性效应（张铣等，1997）。现已有一些国家推荐以90d给药代替慢性给药。

关于给药条件基本上与亚慢性给药条件相同。需强调指出，在给药期间一定要保证合理饮食及适宜的温湿度等环境条件，以防止特别是老年动物不应有的死亡。

3.慢性试验的剂量分组

研究化合物的慢性毒性一般设立3个剂量组与1个对照组，必要时再加1个化合物的溶剂对照组。最大剂量组实验动物应有轻微可见的毒性反应（或者某些化验指标的明确而轻微的改变），最低剂量组应是阈剂量组或是无作用剂量组，依研究目的而定。

选择给药剂量可参考三类数值：（1）以亚慢性试验的阈值或其1／5～1／2为慢性试验的最高剂量，以1／50～1／10为慢性试验中间剂量组，以1／100亚慢性阈剂量为最低剂量组；（2）以亚慢性试验的MTD的1／2剂量为慢性试验的最高剂量组，依次是MTD的1／4、MTD的1／8为下两个剂量组；（3）以该化合物LD₅₀的1／10为最高剂量，依次为1%与1‰。

4.观察指标

同亚慢性毒性试验所介绍的内容。在此强调，由于在慢性试验中，受试化合物的剂量极低，往往一些观察指标变化程度较小，为此需注意如下几点：一是在染毒前对动物一些预计观察指标，如血、尿、肝、肾常规检查及某些生化指标应进行测定，既利于给药后比较，又可对动物健康状况进行筛选。凡是指标差异过大的动物应废弃。二是在给药期间进行定期指标观察时，对照组需同步观察。三是所进行的各项指标应进行质量控制。此外，凡是实验动物在给药期间死亡及给药终止时出现肿物的，必须作病理组织学检查、鉴定。

试验终了，主张将最高剂量组与对照组各留部分动物继续留养1～2个月，以对已显现变化的指标进行追踪观察，有助于探讨受试化合物对实验动物有无后作用及损伤可否恢复。