急性毒性试验方法

五、急性毒性试验方法

1.半数致死量（LD₅₀）的测定

最小致死量是使动物刚好致死的药物剂量，但由于药物的性质、给药方法和个体差异，每只动物的最小致死量有很大的差异。实验和统计学原理表明，一群动物最小致死量的平均值相当于半数致死量。半数致死量测定方法很多，但实验设计大同小异，所不同者为计算方法的不同，其试验方法如下：

（1）预试验：目的是找到一个零死亡的最大剂量和100%死亡最小剂量的估计值以决定实验中采用的最大剂量（Dm）和最小剂量（Dn）。这在LD₅₀测定中非常重要，是实验成功的关键。可用雌性或雄性动物，设四组以上，每组3～4只，先用1∶10的剂量比给药（如5、50、500和5000mg／kg的固定剂量）。观察7d，记录死亡动物数。然后在死亡数4／4和0／4两组之间按1∶2（如50、100、200和400mg／kg）以下的剂量比进行重复试验，以此测得近似的0和100%死亡率。

（2）正式试验：在预试验Dn和Dm剂量范围内按等比设三个以剂量组，其组间剂量的比值一般在1∶0.6～1∶0.9范围内。购入动物实验前应驯化1周，随机或按体重分组，每组10只以上，雌雄各半，分别编号，给药前应禁食（不禁水）过夜。各给药组和溶剂对照组按体重给药后，试验当日多次观察，第二日至最后一日每日观察二次以上并及时详细记录毒性反应症状，症状出现和消失的时间，死亡时间等，第七日全部动物测量体重处死并解剖，肉眼观察病变情况。有毒性反应、体重减轻或脏器有病变的动物应在剖检后立即进行主要脏器的病理组织学观察。

LD₅₀和最小致死量及其可信限的计算可采用Bliss法、简化几率法、改进寇氏法、点斜法或其他LD₅₀的计算方法。计算结果对比表明，不同的计算方法，计算结果间一般无明显差异，而不同实验室对同一样品试验结果常见有显著差异。因此，采用较简单的计算方法完全可以满足LD₅₀计算的准确性。

2.最大给药量试验

如因受试药物的浓度或体积限制，无法测出LD₅₀时，可做最大给药量试验。试验选用拟推荐临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度（试验溶液仍有较好的流动性）最大体积的给药量1次或1d内2～3次给予动物，以小鼠口服为例，动物数不得少于20只，雌雄各半，口服容量一次不超过40mL／kg（体重），多次给药间隔时间不低于4h，观察7d，记录毒性反应和体重变化。如仍未见毒性反应或体重正常增加，则可认为该药物小鼠口服最大给药量未见毒性反应，或LD₅₀大于该最大给药量。经统计学计算，该剂量甚至不可能大于LD14（P＝0.05）。如用10只动物未见毒性反应或死亡则该剂量不可能大于LD26（P＝0.05）。

3.LD₅₀测定举例

（1）孙氏综合法（点斜法）：从苦参中提取分离出一种生物碱单体，经鉴定为苦参碱，现测定其对小鼠的急性毒性。

预试验：设200、150、100、50和25mg／kg五个剂量组，每组处理试鼠10只。将样品配制成不同浓度，采用灌胃法一次性给药，然后正常喂养7d，观察试鼠的反应及死亡情况。结果，剂量在200mg／kg时，试鼠在16h内全部死亡，剂量100mg／kg时，试验期内试鼠死亡8只，剂量50mg／kg时，在试验期试鼠死亡3只，剂量25mg／kg时，在试验期内无试鼠的死亡。由此得出Dm约为120mg／kg，Dn约为30mg／kg。

正式试验：Dm取100mg／kg，组间按八折等比排列，分五组，每组处理试鼠10只，按预试验的方法，采用灌胃法一次性给药进行测定。试验结束后将试验结果的原始数据和计算资料列成表，见表3-6。

表3-6　苦参碱对小鼠的LD₅₀测试原始数据和计算资料

上表内：Dm——估计最大致死量；Xm——Dm的对数值；n——每组动物数；K——组数；i——组间剂量比例的对数；Yh——高半组Y值的均数；Yc——低半组Y值的均数；R——Yh与Yc间的组距数。

按表内数据，可按公式算出苦参碱LD₅₀有关的全部数据。

即苦参碱对试鼠的致死中量为64.00mg／kg。

②LD₅₀的标准误

③LD₅₀的95%平均可信限

④回归线斜率

⑤回归方程

结论：

本例苦参碱对小鼠的LD₅₀＝64.00mg／kg；

LD₅₀的95%平均可信限＝64.00±9.26mg／kg

回归方程：Y＝4.2402x－2.6578

上面公式中，几率单位（Y）可根据试验过程中动物的死亡率由下表（表3－7）查出。

表3-7　死亡率与几率单位互换表

（2）Dixon序贯法（上下法或称阶梯法）：

首先要预先拟定好4～8档剂量组，按等比级数安排剂量。并按下表的样子准备好表格。实验从大剂量开始，给药后，如发生死亡，在表中以“×”记录，下一只动物降低一挡剂量给药，如存活用“Δ”表示，下一只动物则升高一挡剂量给药，依次进行到最后一只动物。以第一次变号的前一个动物作为实验开始。动物数应事先定好，一般用20～30只即可获得较满意的结果。

本法的优点是用的动物少，方法简便，比较节省，适用于毒性出现迅速的药物；但不用于毒性出现缓慢的药物。例如，烟碱对小鼠的毒性测定，方法及结果处理如下。

经预试验设定下表中四档剂量，按灌胃法一次性给药，共用试鼠28只。给药后的结果（存活或死亡）填如下表内（表3-8）。

表3-8　烟碱灌胃法对小鼠的LD₅₀序贯法测定结果列表单位：mg／kg

根据表3-5的实验记录结果，整理实验结果见下表（表3-9）。

表3-9　烟碱灌胃法对小鼠的LD₅₀序贯法测定实验结果整理

i＝0.0457 12 －9 21

（N）（A）（B）

计算：下式中，表内反应数以“Δ”计＋0.5，以“×”计－0.5。

标准误

LD₅₀的95%平均可信