亚慢性毒性试验程序

二、亚慢性毒性试验程序

1.实验动物

一般要求选择两个动物物种，一种为啮齿类动物，常用大鼠；另一种非啮齿类动物，如狗，以便于较全面地了解受试化合物的毒性。大鼠每个给药剂量组用10～20只，狗为4～6只，皆雌雄各半。如设计给药期间处死部分动物作有关指标检验，则每组动物数需相应增加。动物体重要求在给药前差异不超过平均体重的20%。大鼠体重应在100g左右（最好在6周龄），狗的年龄要求为4～6个月。

2.给药条件

当动物为吸入给药时，每口吸入6h；经皮给药，每日涂布给药6h，每周在给药部位重新脱毛一次。需指出，不论经何种途径给药，必须每日定时，且保持良好的温度、湿度环境。

3.亚慢性试验的剂量分组

不论是经消化道吸入或经皮肤途径给药，要求设立3个剂量组。最高剂量组的剂量应使实验动物在给药期间产生明显的中毒症状或某项观察指标发生明显的改变。最高剂量组实验动物应于给药期间不发生死亡。即或有死亡，也应少于动物数的10%。确定最高剂量可参考两个数值，一是以受试化合物急性毒性的阈剂量（相同的实验动物品系，相同给药途径）为亚慢性试验的最高剂量；一是以其LD₅₀的1／20～1／5为最高剂量。最低剂量组中实验动物应无中毒反应或仅有极其轻微的反应，在最高与最低剂量组之间再加一中间剂量组。但无论如何，剂量组间距应大于2倍以上，同时必须设立相同动物数量的对照组，或再加上一个受试化合物所用的溶剂的对照组。此外，有些学者主张为了考察受试化合物中毒作用的可逆性、持久性及迟发效应，最好最高剂量组（或中间剂量组）的动物数加倍，于给药终止后，对余者再继续观察4周左右。

4.观察指标

（1）动物体重：亚慢性试验（包括慢性试验）应重视对受试动物的体重观察。它是非特异性的、反映动物机体中毒效应的综合性指标。实验动物体重增加的抑制或减轻是受多种毒性效应影响的，包括食欲、食物吸收、消化功能、代谢和能量消耗变化等，如果各试验组体重增长抑制呈剂量—反应相关关系，则可以肯定这是一种综合毒性效应。例如每日给大鼠肌注丙烯腈20mg／kg，连续80d，试验组体重增长率与对照组平均体重增长率之差与丙烯腈给药累积剂量呈直线相关。大鼠一般每周称体重—次。

（2）食物利用率：亚慢性试验期间必须注意观察并记录动物每日饮食情况，力争计算动物的食物利用率，即动物每食入100g饲料所增长的体重克数（g体重／100g饲料）。比较给药组与对照组食物利用率，有助于了解受试化合物的毒性效应。如染毒化合物影响动物食欲，则每日进食量减少，体重增长减慢，但食物利用率不—定有改变。若所给化合物干扰食物的吸收或代谢，此时食欲不一定受影响，而体重增长减慢，则食物利用率也发生变化。例如给大鼠喂饲被溴甲烷熏蒸过的饲料两个月，喂饲组与对照组的食物利用率大致相等（分别为25.2%与25.6%），但试验组体重仅相当对照组平均体重的86.6%。说明被溴甲烷熏蒸过的饲料基本上不影响食物的吸收利用，但可能影响了大鼠的食欲。

（3）症状：在给药期间应每日都观察实验动物有无中毒症状及程度，症状观察内容可参阅表3-4和表3-5。此外，还应观察被毛的光洁、色泽。被毛无光、污秽反映动物机体的衰弱。

（4）化验检查：给药前动物应作血及肾、肝功能常规检查，凡有异常的动物需弃之不用。给药期间及给药终止除进行例行的血常规与肝、肾功能检查外，可依受试化合物的化学结构、中毒症状等再增加一些特殊化验项目。?需控制动物的采血量及频度，以保证动物健康。

（5）脏器系数：是指某个脏器与单位体重之比值，或称脏／体比值。单位体重通常以100g体重计，如肝／体比，即指（全肝湿重／体重）×100。这个指标是一个经济的、实用的指标，往往能提供受试化合物的靶标器官的重要线索。其依据是实验动物在到达成年末期或老年期之前，尤其是小动物均随着年龄的增加体重增长，且各脏器与体重之间的重量比值有一定规律。如若受试化合物使某脏器受到损害，此比值将发生改变。例如，凡引起肺水肿或充血的化合物，肺／体比值将增大，引起肺脏纤维化的肺／体比值也将增大（如SiO2给大鼠气管注入后），又如小鼠吸入丙烯腈或腹注后13周，小鼠给药组的肝／体比值均明显增大，且在吸入试验呈现肝／体比值增大与吸人丙烯腈浓度有剂量相关。

但使用脏／体比指标时应注意排除假象。如果受试化合物在试验期间明显抑制实验动物体重增长，虽然某脏器没有受到明显损伤，则也会出现脏／体比值增大。故此时应同时比较试验组动物与对照组动物各脏器的绝对湿重，以校正之。再者，需注意摘取动物脏器后，在称重前应洗去脏器表面的血污，且用滤纸吸干表面水分，再精确称重，但是同时要肪止脏器风干、失水。

（6）病理学检查：应当重视病理学检查。凡在试验期间死亡的和濒死的动物均需及时作病理学检查及病理组织学检查，必要时选择脏器作组织化学或电镜镜检。尤其要注意，凡是临床中毒症状涉及受累器官与系统更需关注。一般讲病理组织学检查应包括全部肉眼可见的损伤部位及脑（多水平）、脊髓、眼与视神经、一些腺体（甲状腺、胸腺等）、心与主动脉、肺与支气管、胃、肠（大、小肠多水平）、肾上腺、肾脏（多水平）、肝脏（多水平）、胰、胆，必要时加上膀胱、骨骼与骨骼肌。