的生物合成的测定

实验三　ATP的生物合成的测定

【实验目的】

1．了解ATP生物合成的意义。

2．掌握无机磷的测定方法。

3．掌握DEAE-纤维素薄板层析法测ATP的形成。

【实验原理】

从糖的酵解代谢反应过程可知，伴随着葡萄糖分解而产生能量，其中间产物固定无机磷，反应过程中生成的几种磷酸化中间产物通过底物水平磷酸化或氧化磷酸化机制合成ATP，以供细胞的需能代谢反应活动。在适当条件下，酿酒酵母分解发酵液中的葡萄糖，释出能量，同时利用无机磷，使AMP转变成ATP，一部分能量即储存于ATP分子中。因此，在发酵过程中，可测得发酵液中的无机磷含量降低和ATP含量的上升。

【实验器材】

1．酿酒酵母，新鲜酿酒酵母悬浮于蒸馏水中，离心，弃去上清液。如此用蒸馏水洗涤酵母数次，最后将洗净的酵母沉淀冷冻保存。

2．AMP、ATP标样。

3．烧杯50 ml或100 ml(×1)。

4．电子分析天平。

5．水浴锅。

6．台式离心机。

7．722型(或7220型)分光光度计。

【药品试剂】

1．2%三氯醋酸溶液:2 g三氯醋酸，溶于100 ml蒸馏水。

2．过氯酸溶液:0．8 ml过氯酸，加蒸馏水8．4 ml。

3．阿米酚试剂:称取2 g阿米酚，与亚硫酸氢钠(NaHSO₃)40 g共同研磨，加蒸馏水200 ml，过滤后储棕色瓶内备用。

4．钼酸铵溶液:20．8 g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，溶于蒸馏水并稀释至200 ml。

5．1 mol/L KOH溶液。6．1 mol/L HCl溶液。7．ATP溶液:称取ATP晶体(或粉末)50 mg，溶于5 ml蒸馏水，临用时配制。

8．DEAE-纤维素薄板:参看第二章脂类实验中的实验三。

9．1 mol/L NaOH溶液。

10．0．05 mol/L pH3．5柠檬酸钠缓冲液:称取柠檬酸12．2 g，柠檬酸钠6．7 g，溶于蒸馏水，稀释至2000 ml。

【实验方法】

1．发酵:

(1)称取0．1 g KH₂PO₄及0．58 g K₂HPO₄溶于3 ml蒸馏水。

(2)另将0．1 g AMP溶于1 ml蒸馏水，倾入上述磷酸钾溶液内，加热至37℃。

(3)取酵母液5 ml，加4 ml蒸馏水稀释，加热至37℃，倒入上述溶液中，再加入MgCl₂0．016 g及葡萄糖0．5 g，再加入蒸馏水3 ml，混匀。

(4)立即取样0．2 ml，检测AMP及无机磷的含量。此时测得的磷称为初磷。薄板层析图谱上只有AMP斑点，无ATP斑点。

(5)以后每隔30分钟取样测定，至明显看出无机磷及AMP含量下降、而ATP含量上升即可(2～3小时)。

2．发酵液样品处理:将每次所取之0．2 ml样液置离心管中，立即加入2%三氯醋酸溶液1 ml，摇匀，3000 r/min条件下离心10分钟。取上清液测无机磷及ATP含量。

3．无机磷测定:吸取经三氯醋酸处理、离心后的上清液0．3 ml置于干试管内加过氯酸溶液8．2 ml、阿米酚试剂0．8 ml、钼酸铵溶液0．4 ml，混匀，10分钟后比色测定A_650nm。

本实验无需求出无机磷的绝对量，故不作标准曲线。A_650nm数值下降即表示无机磷下降。一般情况下，当A_650nm下降至比初磷A_650nm小0．2单位时，发酵液中既有较多的ATP合成。

4．DEAE-纤维素薄板层析法测ATP的形成:用ATP溶液作对照。

(1)DEAE-纤维素的处理:先用水洗，抽干后用4倍体积1 mol/L NaOH溶液浸泡4小时(或搅拌2小时)，抽干，蒸馏水洗至中性，再用4倍体积1 mol/L HCl浸泡2小时(或搅拌1小时)后抽干，蒸馏水洗至pH4备用。

(2)铺板:将处理过的DEAE-纤维素放在烧杯里，加水调成稀糊状，搅匀后立即倒在干净玻璃板上，涂成均匀的薄层，放在水平板上，自然干燥或60℃烘干，备用。

(3)点样:在已烘干的薄板一端2 cm处用铅笔轻画一基线，用微量点样管取10μl样品(样品中核苷酸浓度为每毫升5 mg左右时，点样量为5～10μl)，点在基线上，用冷风吹干。

(4)展层:在烧杯内置pH3．5柠檬酸钠冲液(液体厚度约1 cm)，把点过样的薄板倾斜插入此烧杯内(点样端在下)，溶剂由下而上流动，当溶剂前沿到达距离玻璃板上端约1 cm处(10分钟左右)取出薄板，用热风吹干，用260 nm紫外线照射DEAE-纤维素层观看斑点(图5-1)。DEAE-纤维素经处理可反复使用，如长期不用，需于60℃以下烘干保存。此法具有快速、灵敏的特点。

图5-1 ATP、ADP和AMP的DEAE-纤维素薄板层析图谱

【思考题】

简述ATP生物合成的意义以及测定方法。