食用合成色素的测定

食用合成色素的测定方法很多，黄晓雯用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定红烧老抽中日落黄、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、亮蓝等6种合成色素。罗利军等用导数伏安法同时测定胭脂红、柠檬黄、日落黄、赤藓红等5种混合人工合成色素。龙巍然等用胶束电动毛细管色谱同时测定食品中碱性嫩黄O、苏丹红Ⅰ～Ⅳ、酸性橙Ⅱ、酸性红92、荧光素二钠、日落黄、亮蓝、诱惑红、靛兰、赤藓红和酸性红等13种人工合成色素。还有电化学方法、分光光度法、毛细管电泳法，试剂盒法可以快速检测食品中柠檬黄、日落黄、胭脂红和苋菜红4种合成色素，并可用于现场检测，也有用应用导数荧光光谱和概率神经网络鉴别合成色素的。目前主要用高效液相色谱法和薄层色谱法等。

1. 高效液相色谱法

1)原理

食品中人工合成色素用聚酰胺吸附法或用液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性，与峰面积比较定量。

2)试剂

①甲醇: 经0.5μm滤膜过滤。

②乙酸铵溶液(0.02mol/L): 称取1.54g乙酸铵，加水至1000m L，溶解，经0.45μm滤膜过滤。

③氨水: 量取氨水2m L，加水至100m L，混匀。

④氨水-乙酸铵溶液(0.02 mol/L): 量取氨水(2 +98)0.5 m L，加乙酸铵溶液(0.02mol/L)至1000m L，混匀。

⑤聚酰胺粉: 过200目筛。

⑥甲醇+甲酸(6+4)溶液: 量取甲醇60m L，甲酸40m L，混匀。

⑦柠檬酸溶液: 称取20g柠檬酸(C6H8O7·H2O)，加水至100m L，溶解混匀。

⑧无水乙醇+氨水+水(7+2+1)溶液: 量取无水乙醇70m L，氨水20m L，水10m L，混匀。

⑨三正辛胺+正丁醇溶液(5%): 量取三正辛胺5m L，加正丁醇至100m L，混匀。

⑩饱和硫酸钠溶液。

硫酸钠溶液(2g/L)。

p H的6水: 水中加柠檬酸溶液调p H到6。

合成着色剂标准溶液:准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置100m L容量瓶中，加p H6水至刻度，配置成水溶液(1.00mg/m L)。

合成着色剂标准使用液:临用时上述溶液加p H6水稀释20倍，经0.45μm滤膜过滤，配制成每毫升相当于50.0μg的合成着色剂。

3)仪器

高效液相色谱仪，带紫外检测器，254nm波长。

4)分析步骤

(1)样品处理

①橘子汁、果味水、果子露、汽水等。称取20.0～40.0g，放入100m L烧杯中。含二氧化碳的样品，加热驱除二氧化碳。

②配制酒类。称取20.0～40.0g，放入100m L烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。

③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等。称取5.00～10.00g粉碎样品，放入100m L小烧杯中，加水30m L，温热溶解。若样品溶液p H较高，用柠檬酸溶液调p H到6左右。

④巧克力豆及着色糖衣制品。称取5.00～10.00g，放入100m L小烧杯中，用水反复洗涤色素，直到样品无色素为止，合并色素漂洗液为样品溶液。

(2)色素提取

①聚酰胺吸附法: 样品溶液加柠檬酸溶液调p H到6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成糊状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃p H6的水洗涤3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3～5次(含赤藓红的样品用②法处理)，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合液解吸3～5次，每次5m L，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5m L。经0.45μm滤膜过滤，取10μL进高效液相色谱仪。

②液-液分配法(适用于含赤藓红的样品): 将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2m L盐酸，三正辛胺-正丁醇溶液(5%)10～20m L，振摇提取，分取有机相，重复提取至有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10m L，分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10m L，转移到分液漏斗中，加60m L正己烷，混匀，加氨水(2+98)提取2～3次，每次5m L，合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5m L。经0.45μm滤膜过滤，取10μL进高效液相色谱仪。

(3)高效液相色谱条件

①色谱柱: YWG-C18，4.6mm×250mm10μm不锈钢柱。

②流动相: 甲醇-乙酸铵溶液(p H值为4，0.02mol/L)。

③梯度洗脱: 甲醇20%～35%，3min; 35%～98%，9min，98%继续6min。

④流速: 1m L/min。

⑤检测器: 紫外检测器，波长254nm。

(4)测定

取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

(5)计算

式中: X——样品中着色剂的含量，单位为克每千克(g/kg);

A——样液中着色剂的质量，单位为微克(μg);

V2——进样体积，单位为毫升(m L);

V1——样品稀释液总体积，单位为毫升(m L);

m——样品质量，单位为克(g)。

(6)其他

8种着色剂色谱分离图，见图11-1。

2. 薄层色谱法

1)原理

水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量。

2)试剂

①聚酰胺粉(尼龙6)200目。

②硫酸溶液(1+10)。

③甲醇-甲酸溶液(6+4)。

④柠檬酸溶液(200g/L)。

⑤钨酸钠溶液(100g/L)。

⑥石油醚(沸程60～90℃)。

⑦海砂: 先用盐酸(1+10)煮沸15min，用水洗至中性，再用氢氧化钠溶液(50g/L)煮沸15min，用水洗至中性，再于105℃干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用。

⑧乙醇-氨溶液: 取1m L浓氨水，加乙醇(70%)至100m L，混匀。

图11－1 8种着色剂色谱分离图

1—新红; 2—柠檬黄; 3—苋菜红;

4—靛蓝; 5—胭脂红; 6—日落黄;

7—亮蓝; 8—赤鲜红

⑨乙醇溶液(50%)。

⑩硅胶G。

p H6的水: 用柠檬酸溶液(200g/L)调节至p H值为6。

盐酸(1+10)。

氢氧化钠溶液(50g/L)。

碎瓷片，处理方法同⑦。

展开剂如下:

a.正丁醇-无水乙醇-氨水(1%)(6+2+3)，供纸色谱用。

b.正丁醇-吡啶-氨水(1%)(6+3+4)，供纸色谱用。

c.甲乙酮-丙酮-水(7+3+3)，供纸色谱用。

d.甲醇-乙二胺-氨水(10+3+2)，供薄层色谱用。

e.甲醇-氨水-乙醇(5+1+10)，供薄层色谱用。

f.柠檬酸钠溶液(25g/L) -氨水-乙醇(8+1+2)，供薄层色谱用。

合成着色剂标准溶液:按高效液相色谱法中2)试剂中(13)的方法，分别配制着色剂的标准溶液，其浓度为每毫升相当于1.0mg着色剂。

着色剂标准使用液: 临用时吸取着色剂标准溶液各5.0m L，分别置于50m L容量瓶中，加p H6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.1mg着色剂。

3)仪器

①分光光度计。

②微量注射器或血色素吸管。

③展开槽25cm×6cm×4cm。

④滤纸: 中速滤纸，纸色谱用。

⑤电吹风机。

⑥层析缸。

⑦薄层板: 5cm×20cm。

⑧水泵。

4)操作方法

(1)样品处理

①果味水、果子露、汽水: 称取50.0g样品于100m L烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳。

②配制酒: 称取100.0g样品于烧杯中，加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。

③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖: 称取5.00g或10.0g粉碎的样品，加30m L水，温热溶解，若样液p H较高，用柠檬酸溶液(200g/L)调至p H为4左右。

④奶糖: 称取10.0g粉碎均匀的样品，加30m L乙醇-氨溶液溶解，置水浴上浓缩至约20m L，立即用硫酸(1+10)调至微酸性，再加1.0m L硫酸(1+10)，加1m L钨酸钠溶液(100g/L)，使蛋白质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。

⑤蛋糕类: 称取10.0g粉碎均匀的样品，加海砂少许，混匀，用热风吹干样品(用手摸已干燥即可以)，加入30m L石油醚搅拌，放置片刻，倾出石油醚，如此重复处理三次，以除去脂肪，吹干后研细，全部转入G3漏斗或普通漏斗中，用乙醇-氨溶液提取色素，直至色素全部提完，以下按④自“置水浴上浓缩至约20m L……”起依法操作。

(2)吸附分离

将处理后所得的溶液加热至70℃，加入0.5～1.0g聚酰胺粉充分搅拌，用柠檬酸溶液(200g/L)调p H至4，使着色剂完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。将吸附色素的聚酰胺全部转入G3垂融漏斗中过滤(如用G3垂融漏斗过滤可以用水泵慢慢地抽滤)。用p H6的70℃的水反复洗涤，每次20m L，边洗边搅拌。若含有天然色素，再用甲醇-甲酸溶液洗涤1～3次，每次20m L，至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇-氨溶液分次解吸全部着色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至50m L，用分光光度法进行测定。如果为多种色素混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述溶液置水浴上浓缩至约2m L后移入5m L容量瓶中，用乙醇(50%)洗涤容器，洗涤并入容量瓶中并稀释至刻度。

(3)定性

①纸色谱: 取色谱用纸，在距底边2cm的起始线上分别点3～10μL样品溶液、1～2μL着色剂标准溶液，挂于分别盛有展开剂a、b的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15 cm处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定性。

也可取0.5m L样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的左边点着色剂标准溶液，依法展开，晾干后先定性后再供定量用。靛蓝在碱性条件下易褪色，可用展开试剂c展开。

②薄层色谱。

a.薄层板的制备: 称取1.6g聚酰胺粉、0.4g可溶性淀粉及2g硅胶G，置于合适的研钵中，加15m L水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1h，置干燥器中备用。

b.点样: 离板底边2cm处将0.5m L样液从左到右点成与底边平行的条状，板的左边点2μL色素标准溶液。

c.展开: 苋菜红与胭脂红用展开试剂d展开、靛蓝与亮蓝用展开试剂e展开，柠檬黄与其他色素用展开试剂f展开。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待着色剂明显分开后取出，晾干，与标准斑比较，如比移值相同即为同一色素。

(4)定量

①样品测定: 将纸色谱的条状斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10m L比色管中，并加水稀释至刻度，作比色测定用。

将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸着色剂，少量反复多次至解吸液无色，收集解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移入10m L比色管中，加水至刻度，作比色用。

②标准曲线制备: 分别吸取0m L，0.5m L，1.0m L，2.0m L，3.0m L，4.0m L胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄色素标准使用溶液，或0m L，0.2m L，0.4m L，0.6m L，0.8m L， 1.0m L亮蓝、靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10m L比色管中，各加水稀释至刻度。

上述样品与标准管分别用1cm比色杯，以零号管调节零点，于一定波长下(胭脂红510nm，苋菜红520nm，柠檬黄430nm，日落黄482nm，亮蓝627nm，靛蓝620nm)，测定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较定量。

5) 计算

式中: X——样品中着色剂的含量，单位为克每千克(g/kg);

A——测定用样液中着色剂的质量，单位为毫克(mg);

m——样品质量或体积，单位为克或毫升(g或m L);

V1——样品解吸后总体积，单位为毫升(m L);

V2——样品点板(纸)体积，单位为毫升(m L)。

3. 示波极谱法

1)原理

食品中的合成着色剂，在特定的缓冲溶液中，在滴汞电极上可产生敏感的极谱波，波高与着色剂的浓度成正比。当食品中存在一种或两种以上互不影响测定的着色剂时，可用其进行定性定量分析。

2)试剂

①底液A: 磷酸盐缓冲液(常用于红色和黄色复合色素)，可作觅菜红、胭脂红、日落黄、柠檬黄以及靛蓝着色剂的测定底液。

称取13.6g无水磷酸二氢钾(KH2PO4)和14.1g无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)［或35.6g含结晶水的磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)］及10.0g氯化钠，加水溶解后稀释至1L。

②底液B: 乙酸盐缓冲液(常用于绿色和蓝色复合色素)，可作靛蓝、亮蓝、柠檬黄、日落黄着色剂的测定底液。

量取40.0m L冰乙酸，加水约400m L，加入20.0g无水乙酸钠，溶解后加水稀释至1L。

③柠檬酸溶液: 200g/L。

④乙醇-氨溶液: 取1m L浓氨水，加乙醇(70%)至100m L。

⑤着色剂标准溶液: 准确称取按其纯度折算为100%质量的人工合成着色剂0.100g，溶解后置于100m L容量瓶中，加水至刻度。此溶液1m L含1.00mg着色剂。

⑥着色剂标准使用溶液: 吸取着色剂标准溶液1.00m L，置于100m L容量瓶中，加水至刻度。此溶液1m L含10.0μg着色剂。

3)仪器

①微机极谱仪。

②常用玻璃仪器。

4)分析步骤

(1)试样处理

①饮料和酒类: 取样10.0～25.0m L，加热驱除二氧化碳和乙醇，冷却后用200g/L氢氧化钠和盐酸(1+1)调至中性，然后加蒸馏水至原体积。

②表层色素类: 取样5.0～10.0g，用蒸馏水反复漂洗直至色素完全被洗脱。合并洗脱液并定容至一定体积。

③水果糖和果冻类: 取样5.0g，用水加热溶解，冷却后定容至25.0m L。

④奶油类: 取样5.0g于50m L离心管中，用石油醚洗涤三次，每次为20～30m L，用玻璃棒搅匀，离心，弃上清液。低温挥去残留的石油醚后用乙醇-氨溶液溶解并定容至25.0 m L，离心，取上清液定量水浴蒸干，用适量的水加热溶解色素，用水洗入10m L容量瓶并定容。

⑤奶糖类: 取样5.0g溶于乙醇-氨溶液至25.0m L，离心。取上清液20.0m L，加水20m L，加热挥去约20m L，冷却，用200g/L柠檬酸调p H至4，加入200目聚酰胺粉0.5～1.0g，充分搅拌使色素完全吸附后，用30～40m L酸性水洗入50m L离心管，离心，弃上层液体。沉淀物反复用酸性水洗涤3～4次后，用适量酸性水洗入含滤纸的漏斗中。用乙醇-氨溶液洗脱色素，将洗脱液水浴蒸干，用适量的水加热溶解色素，用水洗入10m L容量瓶并定容。

(2)测定

①极谱条件: 滴汞电极，一阶导数，三电极制，扫描速度250m V/s，底液A的初始扫描电位为-0.2V，终止扫描电位为-0.9V。参考峰电位为苋菜红-0.42V、日落黄-0.50V、柠檬黄-0.56V、胭脂红-0.69V，靛蓝-0.29V。底液B的初始扫描电位为0.0V，终止扫描电位为-1.0V。参考峰电位(溶液、底液偏酸使出峰电位正移，偏碱使出峰电位负移): 靛蓝-0.16V、日落黄-0.32V、柠檬黄-0.45V、亮蓝-0.80V。

②标准曲线: 吸取着色剂标准使用溶液0m L，0.50m L，1.00m L，2.00m L，3.00m L， 4.00m L分别于10m L比色管中，加入5.00m L底液，用水定容至10.0m L(浓度分别为0μg/m L，0.50μg/m L，1.00μg/m L，2.00μg/m L，3.00μg/m L，4.00μg/m L)，混匀后于微机极谱仪上测定。吸取量为0的是试剂空白溶液。

③试样测定: 取试样处理液1.00m L，或一定量(复合色素峰电位较近时，尽量取稀溶液)，加底液5.00m L，加水至10.00m L，摇匀后与标准系列溶液同时测定。

5)计算

式中: X——试样中着色剂的含量，单位为克每升或克每千克(g/L或g/kg);

Cπ——试样测定液中着色剂的含量，单位为微克每毫升(μg/m L);

m——试样取样质量或体积，单位为克或毫升(g或m L);

V1——试样测定液中试样处理液的体积，单位为毫升(m L);

V2——试样稀释后的总体积，单位为毫升(m L)。