降解法测定糖链的序列

实验三　Smith降解法测定糖链的序列

【实验目的】

学习和掌握Smith降解法测定糖链序列的原理和方法。

【实验原理】

Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物(如硼氢化钾或硼氢化钠)还原成稳定的多羟基化合物，然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式及次序。以葡聚糖为例:

1．以1→2位键结合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放;Smith降解后产生甘油。

2．以1→3位键结合的糖基不被高碘酸氧化;Smith降解后仍为原来的糖。

3．以1→4位键结合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放;Smith降解后产生赤藓醇。

4．以1→6位键结合的糖基或非还原末端基(1→6)经高碘酸氧化，消耗二分子高碘酸，同时释放一分子甲酸;Smith降解后产生甘油。

本实验通过纸层析检测终产物中的甘油、赤藓醇和糖。在降解产物中若有赤藓糖生成，则提示多糖具有1→4结合的糖苷键;若有甘油生成，则提示有1→6、1→2结合的糖苷键或有还原末端葡萄糖残基;若能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，则有1→3糖苷键结合的存在。

多糖在浓硫酸中保温一定时间可完全水解为单糖，通过纸层析分离，特定试剂显色后与已知糖的标准混合物作对比，可以鉴定多糖水解产物中单糖的组成。

【药品试剂】

1．0．1 mol/L醋酸。

2．2 mol/L硫酸、1 mol/L硫酸。

3．硼氢化钾。

4．纸层析试剂:

(1)标准糖溶液:称取一定量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖，用蒸馏水溶解，得标准糖混合溶液(每种糖的点样量为20～30μg)。

(2)展层剂:正丁醇∶乙酸:水=4∶1∶5。

(3)显色剂:苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液(邻苯二甲酸1．6 g溶于水饱和的正丁醇100 ml，加苯胺0．93 g，相当于苯胺0．9 ml)。

5．BaCO₃。

6．硝酸银显色剂:

(1)16%硝酸银水溶液:丙酮为1∶9(V/V)。

(2)1%NaOH乙醇溶液(W/V)。

(3)6 mol/L氢氧化铵。

【实验器材】

水解管、滤纸、玻璃毛细管、层析缸、喷雾器。

【实验方法】

1．还原和水解:将高碘酸氧化后经乙二醇处理的溶液用对流水透析48小时，然后用蒸馏水透析24小时，于40℃以下减压浓缩至10 ml左右，加入70 mg硼氢化钾，于室温、暗处搅拌18～24小时以还原多糖醛。用0．1 mol/L醋酸中和至pH6～7，用对流水透析48小时，然后用蒸馏水透析24小时，减压蒸干，加1 mol/L硫酸2 ml，封管，100℃水解8小时，用碳酸钡(BaCO₃)粉末中和，定量滤纸过滤，滤液减压浓缩后，通过纸层析方法检测。

2．纸层析:将层析滤纸剪成7 cm×40 cm的纸条，距层析滤纸一端2 cm处画一横线作为点样线，在点样线上画两个点分别作为标准糖溶液和多糖水解液的点样位置。用玻璃毛细管点样，斑点尽可能小，而且每点一滴，待点样点干燥后，在同一位置再点第二滴。然后将滤纸条悬挂于层析缸中进行层析，展层时间约为36小时。

展层后，将滤纸取出，干燥，喷上硝酸银显色试剂(1)，自然干燥，将滤纸浸入硝酸银显色试剂(2)中，待斑点显出后，再浸入硝酸银显色试剂(3)中以洗去滤纸上的氧化银，然后用水冲洗1小时左右，风干。

3．纸层析结果分析:记录各斑点的位置，绘出层析图谱。根据各显色斑点的颜色相对位置，测算Rf值。以正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5为展层剂时，甘油的Rf值为0．48，赤藓醇的Rf值为0．35。

【思考题】

Smith降解法测定糖链序列的原理是什么?