双链rna是否在体内容易降解

第二节　RNAi的作用机制

RNAi的作用机制是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，形成21～23bp的小干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs），siRNA在细胞内RNA解旋酶作用下解链成正义链和反义链，然后反义siRNA与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA－induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，被切割后的断裂mRNA随即降解，从而抑制该基因在细胞内的表达（图13－1）。

图13－1　RNAi作用机制示意图

RNA酶Ⅲ能切割双链RNA。参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的成员。Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌及哺乳动物细胞内，分子结构中包括1个螺旋酶结构域，2个RNA酶Ⅲ结构域，1个双链RNA结合位点（图13－2，13－3）。在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21～23个核苷酸的siRNA，启动细胞内的RNAi反应。因少量双链RNA即能阻断基因表达，真核细胞中存在以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA－direct－ed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级扩增。双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA；另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后小片段siRNA的正义链与mRNA置换，被mRNA替代。mRNA的位置与最初siRNA的正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解。而mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，降解mRNA。

图13－2　小鼠Dicer酶结构域模式图（含5个保守的结构域）

图13－3　细菌RNA酶Ⅲ结合dsRNA形成复合物的预测结构（浅色与深色表示催化结构域）

由于mRNA也以21～23nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同。另一方面以siRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA的作用成倍数增加，显著增强了对基因表达的抑制作用。RNAi不同于其他基因阻断技术，它通过转录后水平的基因沉默机制起作用，因此，该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都无干涉效应。RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与序列相应的单个内源基因的mRNA，而且抑制效率很高，少量dsRNA就可产生缺失突变体，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果。dsRNA如＜21～23个核苷酸（如10～15个核苷酸），特异性显著降低，会与细胞内非靶向基因结合，出现非特异作用；如远远大于21～23个核苷酸，互补序列可能延伸，超出抑制范围，也会有非特异作用。RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代。