薄层层析法分析膜磷脂

实验三　薄层层析法分析膜磷脂

【实验目的】

1．掌握薄层层析法的原理和操作步骤。

2．掌握膜磷脂的分析方法。

【实验原理】

膜中脂类的主要组分是磷脂和胆固醇。本实验用甲醇-氯仿可将膜中的脂类组分提取出来，同时破坏疏水作用，使膜蛋白变性，再采用薄层层析法进行磷脂的定性分析及定量测定。

薄层层析是将吸附剂或者支持剂(有时加入固化剂)均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。薄层层析是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属于固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。

根据分离的原理不同，薄层层析可以分为用吸附剂铺成的吸附薄层层析和用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的分配薄层层析。薄层层析中以吸附薄层为多用，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同以及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。分配薄层层析是用极性溶剂吸附在固体支持剂上所形成的混合物，铺成薄层(或装柱)，然后活化、点样(或上样)，再用极性较弱的展开剂(或洗脱剂)进行展开。在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配。由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。

【实验器材】

具塞试管、普通离心机、15 cm×15 cm玻璃板、薄层层析展层缸、定磷用的全套器材。

【药品试剂】

1．硅胶H-碱性碳酸镁混合物:称取97 g硅胶H，3 g碱性碳酸镁，置研钵中研磨，并混合均匀。

2．硅胶H-碱性硅酸镁混合物:称取98 g硅胶H，2 g碱性硅酸镁，置研钵中研磨，并混合均匀。

3．磷脂标准样品混合液:称取磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、神经鞘磷脂和卵磷脂等各5 mg，溶于10 ml氯仿∶甲醇(1∶1，V/V)中。

4．氯仿、甲醇、乙酸、氨水、碘和高氯酸。

5．定磷试剂:临用时将下述三溶液与水按如下比例混合，17%硫酸∶2．5%钼酸铵溶液∶10%抗坏血酸溶液:水=1∶1∶1∶2。

A．17%硫酸:17 ml浓硫酸(比重1．84)缓缓加入83 ml水中。

B．2．5%钼酸铵溶液:2．5 g钼酸铵溶于100 ml水。

C．10%抗坏血酸溶液:10 g抗坏血酸溶于100 ml水。储棕色瓶中。溶液呈淡黄色尚可用，呈深黄甚至棕色即失效。

【实验方法】

1．膜脂的提取:

(1)将冰凉干燥的膜制品总重量的一半悬浮于0．8 ml等渗的磷酸盐缓冲液中，加3 ml氯仿∶甲醇(1∶2，V/V)，盖上试管塞，剧烈振荡至少1分钟，另外再加1 ml氯仿振荡1分钟，最后加1 ml水振荡1分钟。

(2)用台式离心机低速离心5分钟，使样品在离心管里分相，缓缓地吸去上相，用细滴管穿过两相界面处变性蛋白的薄层，吸出下相液(膜脂类)，转移到一个小烧杯内，置真空干燥器内蒸发至干。

2．磷脂的分析:

(1)硅胶板的规格及制作方法:准备几块15 cm×15 cm的玻璃板，洗净，烘干或滴上几滴乙醇，用清洁的纱布擦干。取3 g硅胶H-碱性碳酸镁混合物或硅胶H-碱性硅酸镁混合物，置小研钵中。加14 ml 0．5%pH7羧甲基纤维素溶液，研磨数分钟，将研磨好的浆液倒在一块备好的玻璃板上。用玻棒将其铺开，然后轻轻颠动玻璃板，使浆液均匀分布。置于水平台面上，使其自然干燥，然后放在110℃烘箱内活化30分钟，储于真空干燥器内备用。

(2)点样:用200 ml氯仿-甲醇(1∶1，V/V)溶解2 mg干燥的脂类。取100μl溶解的样品溶液，点在薄层板的一个角上距板的边缘约2 mm处，点样的面积直径不超过5 mm，点样一次待样品干燥后再点，重复数次。另取一块薄层板，在同样位置点上磷脂的标准样品混合液(内含每种标准磷脂各20～50μg)。

(3)展层:采用倾斜上行法展层。展层缸内用新配制的溶剂系统平衡，进行双相层析，即在第一相展层后，将薄层板取出，调转90度，再进第二相展层。

第一相溶剂系统:氯仿∶甲醉∶氨水(25%)∶水=90∶54∶5．5∶5．5(体积比);

第二相溶剂系统:氯仿∶甲酵∶乙酸∶水=9∶40∶12∶2(体积比);

每相层析约需2小时，当溶剂前沿距板的顶端2～3 cm时，取出薄层板，用铅笔画出溶剂的前沿位置。第一相展层后，取出，在空气中干燥约15分钟，若空气湿度太大时，则需在放有浓硫酸的干燥器内干燥半小时。玻璃板(20 cm×20 cm)涂上含有硫酸镁的硅胶。脂类的混合物点在右底角(距边缘3 cm处)。展层，第一相溶剂系统氯仿∶甲醇∶氨水(25%)∶水(90∶54∶5．5∶5．5，体积比)，第二相溶剂系统氯仿:甲醇∶乙酸∶水(90∶40∶12∶2，体积比)。

(4)显色及定位:将干燥后的薄层板放入碘缸内，盖好。升华的碘遇磷脂后，发生加成反应，而使磷脂的斑点呈现黄色或棕黄色。斑点显现后，参考磷脂标准样品的相对位置及Rf值，鉴别红细胞膜中含有的磷脂种类。将磷脂的斑点分别从薄层板上刮下来，并转移到试管中，每个样品加1 ml 70%高氯酸，在190℃消化，然后测定磷含量(定磷方法)。在测光吸收之前，应离心除去硅胶。经测定后，从定磷的标准曲线计算出每个磷脂斑点中磷的含量，可推算出每种磷脂在膜中的含量。

【注意事项】

各种脂类的缩写:CHOL=胆固醇，FFA=游离脂肪酸，CL=心磷脂，PA=磷脂酸，PE=磷脂酰乙醇胺，PI=磷脂酰肌醇，PS=磷脂酰丝氨酸，PC=卵磷脂，SPH=鞘磷脂，LPE=溶血磷脂酰乙醇胺，LPC=溶血卵磷脂，LPS=谱溶血磷脂酰丝氨酸，DPI=磷脂酰二磷酸肌醇

【附录】红细胞膜的制备。

【实验材料】

哺乳动物的血液。

【实验器材】

冷冻离心机、冰箱、自动移液管、相差显微镜、冷冻干燥机等。

【药品试剂】

1．含0．15 mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH7．4)。

储液A:称取0．78 g磷酸二氢钠溶于水，定容至1000 ml。储液B:称取3．58 g磷酸氢二钠溶于水，定容至2000 ml。取380 ml储液A和1620 ml储液B混合，用少量浓盐酸调pH值至7．4，再加入17．5 g氯化钠。

2．10 mmol/L pH7．4 Tris-盐酸缓冲液。

3．肝素-磷酸盐缓冲液-pH7．4:肝素溶于10 mmol/L pH7．4 Tris缓冲液，使肝素浓度为500单位/毫升。

【实验方法】

1．血液的收集及洗涤:将血液收集在含有抗凝剂的容器中，每30 ml血液加约5 ml肝素-磷酸盐缓冲液。以下操作均在4℃进行。取30 ml血液，在4℃条件下，3000 r/min离心20分钟，使红细胞沉淀，用吸管吸尽血浆及沉淀的红细胞表层绒毛状沉淀层，以避免其他类型细胞的混入。红细胞置于3倍量预冷的磷酸盐缓冲液中，用玻璃棒缓慢地搅拌悬浮，在4℃条件下，5000 r/min离心15分钟，除去上清液及沉淀表层，重复洗涤3次。

2．溶血和红细胞膜的洗涤:在洗净的红细胞中，按照1∶40的比例加入预冷的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液，边加边缓慢搅拌，置于4℃冰箱中1～2小时，使之完成溶血。4℃，9000 r/min离心15分钟，使红细胞膜沉淀。重复洗涤、离心3～5次，最后获得白色的红细胞膜样品。

3．细胞膜的镜检:取少量膜样品悬液，在相差显微镜下观察，确定膜制品是否纯净。视野中纯净的膜为扁圆形、白色、膜表面略有皱纹。视野中应无完整的红细胞或污染的细菌。

4．膜的冷冻干燥:样品放在一个称好重量的小称量瓶中，冷冻干燥至样品全干，称量带有冷冻干燥制品的小称量瓶，记录膜的产量。将冷冻干燥的膜制品，置于干燥器中保存，以备膜结构成分的分析。