人参总皂苷的提取及薄层层析法鉴定

一、目的要求

1．了解人参皂苷等三萜类化合物的结构与性质。

2．掌握人参皂苷及类似的化合物提取分离原理与方法。

3．熟练掌握薄层层法的原理与制板方法。

4．学习人参总皂苷的薄层层析检测方法。

二、实验原理

人参（Panax ginseng C.A.Meyer）为五加科人参属多年生草本植物，是名贵中药材，人参皂苷（ginsenoside）是人参中最主要药用次生代谢活性成分。目前已从人参根中分离出100 余种人参皂苷单体，现代医学研究证实，人参皂苷具有较好的抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抑制细胞凋亡等药理活性。人参皂苷属于三萜类，是由苷元和糖相连而成的糖苷类化合物。根据苷元不同，人参皂苷可分为 3 种类型：一类是齐墩果烷型五环三萜类皂苷 Ro，其皂苷元为齐墩果酸，另两类是人参二醇型皂苷（如 Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2等）和人参三醇型皂苷（如 Re、Rg1、Rg2、Rf、Rh1 等），两者均属于达玛烷型四环三萜类皂苷，它们在人参皂苷中占大多数，是其中的主要活性成分。图3-4-1为人参二醇型皂苷和人参三醇型皂苷。

图3-4-1 人参二醇型皂苷和人参三醇型皂苷

薄层色谱又称为薄层层析，属于固—液吸附色谱。其基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。当流动相（展开剂）带着混合物组分以不同的速率沿板移动，即组分被吸附剂不断地吸附，又被流动相不断地溶解——解吸而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相也有不同的解吸能力。因此，在流动相向前移动的过程中，不同的组分移动不同的距离而形成了互相分离的斑点。在给定条件下（吸附剂、展开剂的选择，薄层厚度及均匀度等），化合物移动的距离与展开剂前沿移动的距离之比值（Rf值）是给定化合物特有的常数。

影响Rf值的因素很多，如样品的结构、吸附剂和展开剂的性质、温度以及薄层板的质量等。当这些条件都固定时，化合物的比移值Rf是一个特性常数。但由于实验条件容易改变而不易固定，因此在鉴定一个具体化合物时，经常采用与已知标准样品对照的方法。

利用薄层色谱进行分离及鉴定工作，在灵敏、快连、准确方面比纸色谱优越。薄层色谱的特点是：① 设备简单，操作容易；② 分离时间短，只需数分钟到几小时即可得到结果，因而常用来跟踪有机反应，监测有机反应完成的程度；③ 分离能小，斑点集中，特别适用于挥发性小，或在高温下易发生变化而不能用气相色谱分离的物质；④ 可采用腐蚀性的显色剂如浓硫酸，且可在较高温度下显色；⑤ 不仅适用于小量样品（几毫克）的分离，也适用于较大量样品的精制（可达500 mg）。应该指出，薄层色谱是否成功，与样品、使用的吸附剂、展开剂以及薄层的厚度等因素有关。

三、仪器与试剂

水分测定仪如图3-4-2所示。

图3-4-2 水分测定仪

1．试剂

人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rc、硅胶GF254羧甲基纤维素钠、乙酸乙酯、正丁醇、硫酸、甲醇、乙醚、浓盐酸、乙醇。

2．仪器

超纯水机、干燥箱、恒温水浴锅、超声波细胞破碎仪、电子天平、喷壶、电吹风、研钵、移液枪、烧杯、离心管、离心机、减压抽滤装置、层析缸、锥形瓶、玻璃棒、直尺、铅笔、量筒、铁架台、滤纸等。

四、实验操作与步骤

1．人参总皂苷的制备

取适量干燥的人参根或者发根，粉碎成100目左右的粉末，取一定量用80%甲醇60℃浸提（1 g∶40 m L），超声波处理2～3次，每次15 min；60℃水浴蒸干甲醇，然后用5～10 m L水洗溶解（或采用超声波促其溶解），乙醚萃取两次，取水相，然后用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层。60℃蒸干正丁醇，即得到人参总皂苷，用适量的甲醇超声波溶解，定容。

2．薄层层析鉴定人参总皂苷

（1）硅胶薄层板的制备：用电子天平称取8 g GF254硅胶与25 m L 0.5%羧甲基纤维素钠于研钵中，沿同一方向充分研磨30 min，直至成糊状且无气泡，可成珠状滴下时，立即倒在备好的10 cm×20 cm玻璃板中心线上，快速左右倾斜振摇，使糊状物均匀分布在整个板面上，然后水平放在桌面上阴干。

（2）点样：将已经阴干的硅胶板放在烘箱内 105℃活化 0.5～1 h。将活化好的薄层板边缘附着的吸附剂刮净，放置于点样台上，用2B铅笔轻轻地在距离玻璃板下缘1.5 cm处画一横线即点样线。用毛细管吸取约10 μL的已配制好的5 mg/m L人参总皂苷样品甲醇溶液与其他人参皂苷单体样品甲醇溶液在点样线上点样，每个样点间相差1～1.5 cm，点样完成后用吹风机将样品吹干。吹干后置于展开剂正丁醇∶乙酸乙酯∶水（4∶1∶5，V/V/V，上层）展开，当溶剂前沿线与点样线相差8 cm左右时即可将硅胶板取出。

（3）显色：待展开剂挥发后，喷10%（V/V）硫酸—乙醇溶液于烘箱中105℃ 10 min显色，并通过迁移率（Rf）来初步鉴定人参皂苷成分。迁移率计算方法如下：

3．实验结果与分析

拍照记录薄层层析结果，量出各斑点组分的距离，计算Rf值；总结和分析实验成功或失败的原因。

五、实验说明

（1）干燥的人参根是指60℃干燥至恒重。

（2）乙醚萃取过程需要在通风橱中进行，且需要戴上口罩防止吸入乙醚。

六、思考题

1．为了提高薄层层析的效果，防止展开后拖尾、条带不清晰和扭曲等，你认为操作中主要应注意哪些方面的问题？

2．思考如何选择合适的展开剂，有利于目标物质的分离与鉴定？

3．TLC显色方法有哪些？各有什么优势？如何选择这些方法？

4．TLC操作中有哪些要点？各起什么作用？