实验二 氨基酸的薄层层析法
实验目的
（1）了解薄层层析法的一般原理以及层析技术的优点。
（2）掌握硅胶薄层层析法的基本技术。
（3）掌握Rf值的计算方法。
实验原理
薄层层析法是指将固定相支持物（也称吸附剂）均匀铺在玻璃板上使之成为薄层板，将待分析的样品点到薄层板的一端，然后将点样端浸入适宜的展层剂中，在密闭的层析缸中展层。由于各种氨基酸的理化性质（分子极性、分子大小和形状、分子亲和力等）不同，使其在吸附剂表面的吸附能力各异。当展层剂在薄层板的毛细管中移动时，点在薄层板上样品的组分就不同程度地随着展层剂的移动而移动，使不同的氨基酸得以分离。层析完毕后，可用茚三酮无水乙醇溶液喷洒薄层板，使氨基酸斑点显色。各种氨基酸都有其特征的移动速率（Rf），因此可根据Rf值来鉴定被分离的氨基酸。
薄层层析法操作简便、快速、灵敏、分离效果好、显色容易，被广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂类、生物碱等多种物质的分离和鉴定。
实验试剂与实验器材
1.实验试剂
（1）0.1mol／L盐酸：吸取浓盐酸0.84mL，加入到适量蒸馏水中，再加蒸馏水至100mL刻度。
（2）氨基酸混合液：称取甘氨酸100mg、酪氨酸100mg、亮氨酸50mg，共同加入小烧杯中，加0.1mol／L盐酸10mL，使氨基酸溶解。
（3）氨基酸标准液：准确称取甘氨酸100mg、酪氨酸100mg、亮氨酸50 mg，分别加入小烧杯中，各加0.1mol／L盐酸10mL，使氨基酸溶解。
（4）展层剂：正丁醇∶冰乙酸∶蒸馏水＝4∶1∶5（体积比），三者充分振荡混匀，静置2h，待分层后取上清液备用。
（5）显色剂：0.1%茚三酮无水乙醇溶液。
（6）硅胶G：按18目硅胶∶煅石膏＝17∶3（W／W）混匀，即得硅胶G。
（7）0.5%羧甲基纤维素钠：称取5g羧甲基纤维素钠加入1L蒸馏水中，加热搅拌，煮沸至透明状，放冷后备用。
2.实验器材
托盘天平、立式层析缸、玻璃喷雾器、吹风机、烘箱、玻璃板（大小为5.5cm×10cm，厚约2mm）、量筒（100mL）、烧杯（50mL）、微量吸管或点样毛细管、研钵、玻璃棒、橡胶手套、铅笔、直尺等。
实验步骤
（1）铺板：按硅胶G∶0.5%羧甲基纤维素钠＝2∶5（W／W）的比例，将硅胶G在研钵中研磨成糊，加乙醇数滴去除气泡。取大小为5.5cm×20cm、厚约2mm的玻璃板一块，在其纵向两侧用1.5cm×20cm、厚约3mm的玻璃条夹住，水平放置，在玻璃板的一端倒上调好的硅胶G糊，然后用玻璃棒将硅胶G糊刮向另一端推平，即制成1mm厚的薄层板，在室温下干燥。
（2）活化：将薄层板置于烘箱中在105℃下烘烤60min使其活化，再置于干燥器中备用。
（3）点样：用毛细管点样，每个斑点点两次，点样后用热吹风机吹干。操作者应戴上橡胶手套操作。
（4）展层：将适量展层剂倒入层析缸，加盖密闭，保持10min，使缸内展层剂蒸气达到饱和。将硅胶G薄层板放进立式层析缸内，使点样端浸入展层剂中约0.5cm，注意不可使点样点浸入展层剂，加盖密闭，进行层析。当展层剂前沿达到薄层板3／4高度时，将薄层板自层析缸内取出，用铅笔标记溶剂前沿，用吹风机吹干。
（5）显色：用玻璃喷雾器向薄层板均匀喷洒0.1%茚三酮无水乙醇溶液，待乙醇挥发后，将薄层板置于烤箱中在105℃下烘烤，至呈现紫红色氨基酸斑点为止。
结果处理
用铅笔画出各斑点（层析点）的位置，测量斑点（层析点）中心与原点的距离和溶剂前沿与原点的距离，计算其Rf值。
注意事项
（1）硅胶研磨要充分，中间不能有气泡。
（2）薄层板要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹。
（3）点样点直径不应超过0.5cm，待点样点干燥后再层析。
（4）浸入展层剂深度以0.5cm为宜，点样点切不可浸入展层剂中。
（5）层析缸密闭性要好，保证其中展层剂蒸气达到饱和。
（6）显色剂喷洒要均匀，显色后烘干至呈现紫红色氨基酸斑点即可，避免过分烘烤导致硅胶龟裂或脱落。
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