离子交换柱层析分离混合氨基酸

一、目的要求

1．学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。

2．掌握离子交换柱层析的基本操作。

3．掌握氨基酸和茚三酮显色机理。

二、实验原理

离子交换层析分离混合氨基酸是基于氨基酸电荷行为不同来进行的，氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的 p H 值。其中酸性氨基酸天冬氨酸的p I为2.97，碱性氨基酸赖氨酸的p I为9.74，在p H5.3条件下，因为p H值低于赖氨酸的p I值，赖氨酸可解离成阳离子结合在 732 树脂上；天冬氨酸可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在p H12条件下，因p H值高于赖氨酸的p I值，赖氨酸可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样通过改变洗脱液的p H值，可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。

三、仪器与试剂

1．仪器

层析装置（20 cm×1 cm）（图3-8-1）、铁架台、恒流泵、部分收集器、分光光度计、移液枪、恒温水浴锅、试管、玻璃棒、烧杯、试管架。

2．试剂

（1）732型阳离子交换树脂（100～200目）。

（2）2 mol/L氢氧化钠溶液，1 mol/L氢氧化钠溶液。

图3-8-1 层析装置

（3）2 mol/L盐酸溶液，0.1 mol/L盐酸溶液。

（4）标准氨基酸溶液。天冬氨酸、赖氨酸均配制成2 mg/m L的0.1 mol/L盐酸溶液。

（5）洗脱液。柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液（p H5.3）：取柠檬酸 14.25 g，氢氧化钠9.30 g和浓盐酸5.25 m L溶于少量水后，定容至500 m L，冰箱保存。

0.01 mol/L Na OH溶液（p H12）：取0.4 g Na OH固体用适量蒸馏水溶解后，定容至1 L。

（6）显色剂。取0.5 g茚三酮溶于75 m L乙二醇单甲醚中，加水定容至100 m L。

（7）待测样品。混合氨基酸溶液：将2 mg/m L天冬氨酸、赖氨酸溶液按1∶2.5的比例混合，混合后再以1∶1的比例用0.1 mol/L盐酸溶液稀释。

四、实验操作与步骤

1．树脂的处理

对于市售干树脂，先是经水充分溶胀后，经浮选得到颗粒大小合适的树脂，然后加 4 倍量的2 mol/L HCl溶液浸泡1 h，倾去酸液，用蒸馏水洗至中性，然后用2 mol/L Na OH溶液处理，做法同上。以1 mol/L Na OH溶液浸泡树脂1 h转化为钠型，用蒸馏水洗至中性，最后用欲使用的柠檬酸缓冲液浸泡，过剩的树脂浸入 1 mol/L Na OH 溶液中保存，以防细菌生长。

2．装柱

取层析柱一支，垂直固定在铁架台上（实验前需进行检漏，小老师会在实验过程中进行演示），用夹子夹紧柱底出口处橡胶管，在柱内加2～3 cm高的柠檬酸缓冲液。将搅拌成悬浮状的树脂沿柱内壁缓慢倒入。待树脂在柱底部逐渐沉降时，慢慢打开柱底出口处铁夹，继续加入树脂悬浮液，直至树脂高度到层析柱高度的3/4处。

3．平衡

层析柱装好后，再缓慢沿管壁加入适量缓冲液至树脂床面以上 2～3 cm 处，接上横流泵，用柠檬酸缓冲液以0.5 m L/min的流速进行平衡，用p H试纸测量流出液p H值，直至流出液的p H值与缓冲液的p H值相等。

4．加样

关闭恒流泵，打开层析柱上端管口，缓慢打开柱底出口，小心放出层析柱内的液体至柱内液体的凹液面恰好与树脂上液面相齐，立即关闭下端出口（注意：不要使液面下降至树脂表面以下）。用移液枪吸取氨基酸混合样品 0.5 m L，沿靠近树脂表面的管壁缓慢加入，注意不要冲坏树脂表面。加样后打开柱底止水夹，使液体尽可能缓慢地流下至液体凹液面，恰与树脂表面相平，立即关闭止水夹。再用胶头滴管吸取0.5 m L缓冲液清洗柱内壁，打开止水夹放出液体，使液体下表面与树脂表面相平，按照此法清洗 2 次。然后小心加入缓冲液离柱顶部1 cm为止，并将层析柱与恒流泵和部分收集器相连。

5．洗脱

（1）缓冲液洗脱：用柠檬酸缓冲液（p H5.3）以6 s/滴的流速开始洗脱，用试管收集洗脱液，每管收集1 m L，收集1～10号管。

（2）0.01 mol/L Na OH 溶液（p H12）洗脱：关闭恒流泵和止水夹，将柠檬酸缓冲液更换为0.01 mol/L的Na OH溶液，打开止水夹进行洗脱，同法收集11～40管。

收集完毕后，关闭止水夹和恒流泵。

6．测定

分别向60管收集液中加入1.5 m L柠檬酸缓冲液，混匀后再加入1 m L茚三酮显色剂，混匀。沸水浴15 min后取出，冷却至室温，在1 h内用分光光度计在570 nm下以蒸馏水为空白管进行比色，测定各管的吸光度值。

7．树脂再生

层析柱使用几次后，需将树脂取出用1 mol/L Na OH溶液洗涤，再用蒸馏水洗至中性后可反复使用。

8．绘制曲线

以吸光度值为纵坐标、收集的管数为横坐标，绘制出洗脱曲线。

五、实验说明

（1）在配制柠檬酸缓冲液时，需要加入0.1%酚溶液可防止长霉。在室温较高的夏季，配制缓冲溶液用的蒸馏水必须是新鲜蒸馏水，配前煮沸，配好后在4℃保存。

（2）要注意装柱过程的连续性，装好的层析柱应均匀，防止产生气泡、节痕或界面，否则会对实验有较大的影响，如有气泡必须重新装柱；树脂颗粒不能出现在层析柱管口，以免漏气。

（3）平衡过程时，调节流速前要排除恒流泵与柱间连接管内所有气泡，以免影响流速，影响实验效果。调节流速时统一将流速调节为10滴/min，平衡时间一般为15 min。

（4）加样时，样品体积不要过大，样品的含量不能超过层析柱内离子交换能力，否则影响分离效果。

（5）洗脱时，在整个实验过程中要多注意层析柱，避免使柱内液体流干，否则实验即为失败，并且一定要让出液口对准试管，留心观察，有些仪器有偏差。

（6）树脂可再生使用，使用完毕一定要放在指定的容器中。

六、思考题

1．对于新树脂我们做的处理是先用2 mol/L HCl搅拌0.5 h，然后用蒸馏水洗至中性，再用2 mol/L Na OH搅拌0.5 h，用蒸馏水洗至中性，最后用1 mol/L Na OH搅拌0.5 h，还用蒸馏水洗至中性。请分析原因。

2．所加树脂的高度为层析柱高度的 3/4，思考树脂过高或过低对实验结果有何影响？试分析原因。

3．本实验加的样品为天冬氨酸和赖氨酸，若再加一个组氨酸，试估计其峰值的位置，说明理由。