标本的接收

时间：2022-05-20 理论教育版权反馈

【摘要】：病理标本的接收是在取材前要做的工作，它是临床与病理科联系的一个重要环节，它为开展病理学检查、病理档案的保存奠定了基础。应积极实行病理学检查资料的计算机管理。

学习目标

◆会制作优质的切片。

◆了解病理切片技术的分类。

◆熟悉常用固定液的配制和使用。

任务描述

病理组织切片技术是病理诊断的重要步骤，包括取材、固定、脱水、包埋、切片、染色等步骤。只有规范操作，才能制作优质的切片，为提高病理诊断水平提供有力保障。

病理形态学的检查通过观察大体标本的病理改变，切取一定大小的病变组织，用病理组织学方法制成病理切片，通过显微镜检查病变性质，进而探讨病变产生的原因、发病机制、病变的发生发展过程，最后做出病理诊断。其中病理切片制作为其中重要环节，我们称之为组织病理学技术或病理组织切片技术。

病理组织切片技术的主要过程有取材、固定、脱水、包埋、切片、染色。每个过程又包含若干步骤。这些过程相互关联、相互影响，每一个环节的操作是否规范都将影响着最终切片的质量。因此，病理技术工作者要有高度的责任心，认真、细致、规范操作，制作优质的切片，为提高病理诊断准确度提供有力保障。

病理切片技术应用临床已有一百多年的历史了。最早应用的只是冰冻切片，随着冰冻切片的应用和实践又进一步利用石蜡的硬度，将要检查的组织块包埋于这种坚实的介质中，成为到目前为止应用最为广泛的切片技术。后来又出现了利用明胶、火棉胶等物质的韧性来包埋组织，制成了明胶切片和火棉胶切片。又逐渐出现了树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法。

（一）石蜡切片技术

石蜡切片法是将组织经过固定、脱水、浸蜡等操作处理，用石蜡浸入组织，包埋形成蜡块，再把蜡块切成适宜厚度薄片的技术。是目前临床、科研应用最为广泛的切片技术。

（二）冰冻切片技术

冰冻切片技术是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，不经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等过程，极大缩短了制片的时间，是最为简便快捷的制片技术。目前主要应用于手术中确定病变良、恶性，确定手术方案及手术切除范围。另外，在某些科研工作中也有相应的应用。

1.优点

（1）简便，不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等过程即可进行切片，减少了一些中间环节。

（2）快速，用时短。

（3）组织变化不大。

（4）能很好保存脂肪、类脂等成分。

（5）能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是那些对有机溶剂或热耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。

2.缺点

（1）不容易做连续切片。

（2）切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。

（3）不容易制作较薄的切片。

（4）组织块在冻结过程中容易产生冰晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。

（三）火棉胶切片技术

火棉胶切片技术是将组织按常规方法固定、脱水，即刻将组织移入火棉胶中，浓度经过逐步增加，形成火棉胶块，再入氯仿中硬化，进而切成适宜厚度，以满足临床科研及诊断的需求。火棉胶切片技术适用于大块或较坚硬的组织，常用于眼球、内耳、肌腱、脱钙骨和神经组织的一些特殊染色方法。

优点：火棉胶能弥补石蜡制片的不足，其韧性强，能减少组织的收缩和硬化，切片不易卷曲及破碎，能保持组织原有的结构和形态的完整性，对于较大、较坚硬的组织和囊状易塌陷的器官等制片较好。缺点是制片时间较长，切片厚，操作复杂。

病理标本的接收是在取材前要做的工作，它是临床与病理科联系的一个重要环节，它为开展病理学检查、病理档案的保存奠定了基础。接收工作包括两个部分：标本和病理申请单的接收。

（一）常规标本接收及注意事项

1.病理科应有专人验收常规活检申请单和送检标本。

2.认真核对申请单与送检标本是否一致。包括取材部位和组织块数量，发现疑问时，应立即向送检方提出并在申请单上注明。

3.认真审阅申请单的各项信息是否清楚，包括：病人基本情况（姓名、性别、年龄、送检单位、床位、门诊号、住院号、送检日期、取材部位、标本数量等），病人其他情况（病史、化验、影像结果、手术所见、既往病理学检查情况和临床诊断等）。

4.送检标本固定液不符合技术要求时，应尽快按相关的技术要求来进行固定或预处理。

5.接收手术中送检标本时，有交接手续制度，认真核对、验收、交接者双签名。

6.病理科验收标本人员在已验收的申请单上注明验收日期，及时编号并逐项录入活检标本登记簿，并将相应编号条放入标本容器内。

7.发现送检标本与申请单不相符时，应主动及时与申请者取得联系。

8.接收标本人员不得对申请单中临床医师填写的各项内容进行改动。

对如下情况，拒收送检标本：

（1）申请单与相关标本未同时送达病理科。

（2）申请单中填写的内容与送检标本不符合。

（3）标本上无病人姓名、科室等。

（4）申请单内填写的字迹潦草不清。

（5）申请单中漏填重要项目。

（6）标本严重自溶、腐败、干涸等。

（7）标本过小，不能或难以制作切片。

（8）其他可能影响病理检查可行性和诊断准确性的情况。

对于不能接收的申请单和标本应一并退回，不予存放。

（二）细胞学标本接收及注意事项

1.凡送病理科做细胞学检查标本，必须由病理科工作人员查验合格后接收并双签名。对有问题的标本或申请单，退回临床科室查清与校对。

2.验收人员要认真查对申请单上病人的姓名、年龄、性别、住院号、科室、诊断等信息是否齐全清楚。

3.查验胸水、腹水、尿液、痰液、宫颈刮片是否新鲜，有无干涸，玻片数目与申请单是否一致，若有不符，应与送检科室联系。

4.如遇到送检标本与申请单不相符的情况，应主动及时与申请者取得联系。

（三）术中冰冻标本接收及注意事项

1.做冰冻切片的组织或器官一经送至病理科，将实行严格的查对制度。

2.查对申请单上的姓名、序号、床位、组织或器官名称、部位和个数与标本是否相符，确定无误后签名接收，并记录接收时间，精确到秒。

3.对接收的标本编号。

4.主持手术的临床医师应在手术前一天向病理科递交快速活检申请单，填写病人的病史，重要的影像学资料、实验室检查结果和提请病理医师特别关注的问题等。尽可能不在手术过程中临时申请快速活检。

5.掌握术中冰冻的适应证，对不能或不适宜进行术中冰冻检查的标本不予以接收。

接收的标本和申请单，由技术人员在已验收的申请单上签名并注明验收时间，及时准确进行病理学检查编号，同时，逐项记录在病理学检查登记簿上或录入计算机，编号必须注意逐项分类进行，严防错编、漏编。常用的分类方法有：

1.活体组织检查标本　以“外”或“S”为字首进行标号。

2.体液检查标本　以“液”或“F”为字首进行标号。

3.实验动物标本　以“动”或“E”为字首进行标号。

4.尸体剖验标本　以“尸”或“A”为字首进行标号。

标本的病理号可按年编序（如S201300156），或连续性编序（如3754126）。

注意：一次病例的申请单、活检标本应登记在登记簿上或录入计算机，放置标本的容器、组织的石蜡包埋块（简称蜡块）及其切片等的病理号必须完全一致。

（一）标本的储存

凡送病理学检查的标本均需加固定液保存（如10%中性福尔马林、95%乙醇）。对已验收合格的标本，须酌情更换固定容器并添加适量固定液保存。

1.活检标本保存　活检标本自签发病理学诊断报告书之日起保存2～4周，具体保存期限由各医院自行规定。

2.尸检标本保存

（1）普通病理尸检　自签发病理学诊断报告书之日起保存3个月。

（2）涉及医患争议的尸检　按照尸检前有关各方签署的协议办理。

（二）病理资料的储存

常规活检、手术中快速活检、细胞病理学检查和尸检等的文字资料（含电子信息资料）、非文字资料（组织的石蜡包埋块、切片等），以及其他相关资料均为有价值的医学资料，皆由病理科按照规定妥善保存。病理科必须设立病理档案资料室和制定病理档案资料管理制度（包括病理检查资料的归档、借用和归还手续等），并有专人管理。应积极实行病理学检查资料的计算机管理。

1.各种病理学检查的文字资料应装订成册保存。

2.对已做出常规活检、快速活检、尸检病理学诊断的原始组织学切片和查见肿瘤细胞或可疑肿瘤细胞的玻片必须妥善保存30年。

未查见恶性肿瘤细胞学的玻片，于诊断报告书发出后保存2周。

3.病人查询病理学检查资料的期限：①门诊病人为送检后15年；②住院病人为送检后30年。

取材是制作病理切片的第一步，取材的正确与否关系到切片的质量，直接影响病理诊断和科研工作的结果。取材需要病理医师与病理技师协同配合，病理医师口述肉眼所见标本色泽、形状、质地；技师做记录，记录内容一定要详细，条理清晰。

（一）取材工具

取材常用工具包括：取材刀、手术剪、血管钳、手术镊、直尺、骨锯、骨刀等。要求取材刀具必须锋利，切取组织尽量避免挤压和揉擦，避免使用有齿镊等手术器械，以免人为损害组织，为诊断带来困难。

（二）取材的要求

1.取材组织要求　取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后迅速固定，以保证原有的形态学结构。

2.组织块的大小　所取组织块较理想的体积为1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部为宜；但根据制片材料和目的不同，组织块的体积也不同，如制作科研切片或有特殊要求时，其组织块以薄取0.1～0.2 cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间。若制作教学切片厚取0.3～0.5 cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。

3.勿挤压组织块　切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。并尽可能少破坏标本外观的可复原性，以便再次观察、与切片对照观察或补取组织块。

4.规范取材部位　要准确地按解剖部位取材，应尽量选择病变或可疑病变的组织。必要时可选择病变组织与正常组织交界处。切取标本的原则是求准而非量多。另外，取材应该避免过多坏死组织或凝血块，如有线结应拔除。

5.选好组织块的切面　根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。

6.保持材料的清洁　组织块上如有血液、污物、黏液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。

7.保持组织的原有形态　新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平或用大头针定在木板上，以尽可能维持原形。

常见器官或组织的取材要点及注意事项见表2-1。

表2-1　常见器官或组织的取材要点及注意事项

注：凡进入固定程序的标本必须连带其正确无误的病理检验号或病理号

（三）取材的注意事项

1.取出所有送检的标本，量其大小，称其重量，描写其色泽、质地、形状和肉眼所见表面情况。当标本切开后，应详细描写其切面的颜色、硬度、病变部位等，必要时绘图、拍照说明。

2.对于细小标本如肺支气管穿刺物标本、胃肠镜活检标本等，应将其染上伊红后，用擦镜纸或特别脱水袋将其包上或装上，以防漏出脱水盒的小孔。

3.对于有传染性的标本，让标本彻底固定后再取材。如结核瘤标本等。

4.对于罕见特殊的标本，应小心保存好，在不影响诊断的情况下，尽量保存好大体标本。以利于教学标本、陈列标本的收集。

5.组织标本较多的单位，取材经常要花上几个小时，边取材边固定可使先取的材料多固定几个小时，如此可以防止固定时间不足，同时也可防止组织发生自溶。

6.对于骨髓穿刺的组织，可先用10%硝酸浸泡30min左右，然后再与其他组织进行处理。

7.骨组织和钙化组织，应彻底脱钙后，方能进行制作切片。

8.活检组织取材，不能太厚，以不超过2 mm为宜。以防脱水不彻底，不利于制片。

9.每取完一例标本后，所有的工具如刀、剪、盘、镊、切板等，必须用水冲洗干净，以免污染，混淆于其他病例。

10.组织取完即刻放入打印好号码的盒内，放入固定液中固定。

11.对包埋方向有要求的，须标明包埋方向，如包埋标本切缘、囊壁组织等，保证切缘、囊壁组织全层都能被观察到。

将组织侵入某些化学试剂，使细胞内的物质能尽量保持其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称之为固定。固定所用的化学试剂称为固定剂。

（一）固定的作用

1.保持组织细胞与生活时相似的结构和形态，防止离体组织自溶和细菌繁殖导致的组织腐败。

2.保持定位细胞内特殊成分，如细胞内的一些蛋白质经过固定，可沉淀或凝固定位在细胞的原有位置。

3.便于区别不同组织成分，固定可使组织细胞中各种成分的沉淀凝固并易于着色，同时固定后组织细胞内的不同物质可产生不同折光率，对染料产生不同的亲和力，因而经染色后容易加以区别。

4.有利于切片，固定剂兼有组织硬化作用，固定后的组织硬度增加，易于切片。

5.保存抗原及DNA、RNA，特别是准备用于做免疫组化染色和核酸原位杂交的标本，及时恰当的固定尤其重要。

（二）固定方法

常用的固定方法有以下几种：

1.浸泡固定法　将标本直接放入固定液中进行固定，称之为浸泡固定法。为最常用的固定方法。固定液量为标本体积的10倍左右；固定时间应充分，为3～12 h；固定温度为25 ℃。临床病理、尸检，科研标本制作均用此方。

2.蒸汽固定法　固定液（如甲醛、三聚甲醛、锇酸等）加热后产生的蒸汽对组织进行固定的方法，称之为蒸汽固定。常用于组织中的可溶性物质、血液或细胞涂片的固定。

3.注射、灌注固定法　将固定液注射或灌注到血管或腔道内，使组织、器官被固定的方法，称之为注射、灌注固定法。常用于某些组织块体积较大或固定剂难以浸入其内部的标本，或需要对整个脏器或动物标本进行固定。

4.滴加固定法　将固定剂滴加到组织标本，使其固定的方法，称之为滴加固定法。常用于体液细胞学制片，如胸水和腹水脱落细胞学检查、血涂片及各种组织印片的固定，现在已较少使用。

5.微波固定法　将组织块浸入固定液中，置于医用微波仪内，经微波作用加速组织固定的方法，称之为微波固定法。微波固定的组织具有核膜清晰、染色均匀、组织结构收缩小等优点，但应用时应严格控制温度（63～65 ℃）。一般不主张用微波固定小块活检组织。

（三）常用的固定剂

用于固定组织的化学物质称之为固定液或固定剂。固定液的种类很多，由单一化学物质组成的称之为单纯固定液，如甲醛、乙醇、乙酸。由多种化学物质混合组成的称之为混合固定液，如中性福尔马林、乙醇-甲醛液等。不同的固定液有各自的特点，可根据实际的需求进行选择。理想的固定剂应该具备以下几种特性：①渗透性强，必须使固定液迅速渗入组织，这样组织内各种成分才能尽快地被固定在原位置，而不致弥散；②组织在固定液的作用下不发生显著的收缩和膨胀现象，实际上，经过固定的组织由于蛋白质发生凝固或沉淀，必然会发生一定程度收缩或膨胀，良好的固定液应尽量较少使组织发生这种变化；③固定液应有利于组织切片和染色，固定液能将组织或细胞中某些必须观察的成分充分固定而保存下来以便染色；④固定液应该是一种较好的保存液。

1.单纯固定液

（1）甲醛　是一种可溶于水的气体，极易挥发，市售的为40%的甲醛水溶液，也称为福尔马林溶液，价钱较便宜，而且组织穿透力强，固定均匀，组织收缩小，可长期保存标本，适合多种特殊染色，对脂类和类脂类、神经及髓鞘均有良好的固定效果。可固定高尔基体、线粒体和糖类。甲醛是一种交联性组织固定剂，主要通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用，它虽不能使白蛋白和核蛋白沉淀，但能与蛋白质中许多氨基酸如赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸等反应。一般作为固定剂使用的是10%中性福尔马林，配制方法为10mL原液加90mL的蒸馏水，此液中甲醛试剂浓度为4%。

（2）中性甲醛　是以pH值7.2～7.4的磷酸缓冲液（PBS）为溶剂配置的甲醛溶液，浓度为4%。中性甲醛的固定效果对组织抗原性的保存优于一般的甲醛溶液，是人体和实验动物最适宜的固定液。

甲醛（40%）　　　　　　　　100mL

无水磷酸氢二钠　　　　　　 6.5g

磷酸二氢钠　　　　　　　　 4.0g

蒸馏水　　　　　　　　　　 900mL

（3）乙醇　又称酒精，为无色液体，可与水以任何比例相溶。具有硬化、固定、脱水作用，但组织渗透力较弱。作为固定液使用时最适宜体积分数（浓度）为80%～95%，乙醇能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋白沉淀后能溶于水，所以乙醇作为固定剂不利于染色体的固定，以致核染色不良。此外，高浓度乙醇固定的组织硬化显著，若留置过久，组织收缩明显，不但影响制片，组织形态也较差。70%乙醇可较久的保存组织。50%以上的乙醇可溶解脂肪组织及类脂质，又能溶解血红蛋白及损害其他色素，若需保留这些物质不能用乙醇做固定剂。此外，如须证明尿酸结晶和保存糖类，可用无水乙醇固定。现在病理检验中较少单独作为固定剂使用。

（4）乙酸　又称醋酸、冰醋酸。为无色具有强烈刺激性的酸性溶液，可与水、乙醇以任何比例相溶。乙酸可使胶原纤维肿胀，故不能单独使用，但在混合固定液中有抵抗其他试剂致细胞收缩的作用。因此，乙酸常同乙醇配置成为混合固定液来抵消经过固定所引起组织的高度收缩和硬化作用。一般做固定液使用质量分数为0.3%～5%，乙酸可使核蛋白沉淀，因此，染色剂固定很快，是染色质的良好固定剂。对蛋白质具有保存作用，对脂类及糖类不产生影响，高浓度乙酸则可溶解脂肪及类脂，使线粒体和高尔基体被破坏或变形，因此，配制含乙酸的混合液时，其质量分数不超过5%。

（5）苦味酸　为一种具有毒性黄色晶体，味苦，在空气中干燥时有爆炸性，故需湿保存。通常用作固定的是饱和液，质量分数为0.9%～1.2%。经苦味酸固定的组织做三色染色可使颜色对比鲜明。苦味酸对于组织渗透缓慢，且能使组织强烈收缩。但可使蛋白质、核酸等沉淀，并防止过度硬化，对以后增进染色能力很大。一般很少单独使用，常与其他药剂混合使用。固定后需要用50％或70％乙醇洗涤。

2.混合固定液

（1）乙醇-甲醛液（AF液）　有固定兼脱水作用，适用于皮下组织中肥大细胞的固定。固定后可直接入95%乙醇脱水，缩短了脱水时间。

95%乙醇　　　　90mL

40%甲醛　　　　10mL

（2）Bouin液　是一种常规用于活检标本固定的固定液。渗透力较强，对组织固定均匀，收缩很小，不会使组织变硬变脆，特别适用于睾丸组织的固定。小块组织只需固定数小时，较大脏器固定12～24 h为宜。Bouin液偏酸性，并有一定毒性，应避免吸入或与皮肤接触，不适用标本长期固定。

苦味酸饱和水溶液　　　　 75mL

40%甲醛水溶液　　　　　　25mL

冰醋酸　　　　　　　　　 5mL

或80%乙醇　　　　　　　　150mL

40%甲醛　　　　　　　　　60mL

冰醋酸　　　　　　　　　 15mL

结晶苦味酸　　　　　　　 1g

本液临用时配制。组织块置于Bouin液固定12～24 h即可（小块组织只需固定数小时）。经Bouin液固定的组织被苦味酸染成黄色，可用水洗涤12 h后进入乙醇脱水脱色。不必将组织中的黄色除净。

（3）Zenker液　适用于一般组织固定，胞核和胞质染色颇为清晰，对酸性染料染色有媒介作用，常用作血性样本及三色染色的固定。一般固定12～24 h即可。固定后流水冲洗组织块12 h，染色前须经过脱汞处理。配制该溶液较昂贵，且须处理汞。

重铬酸钾　　　　2.5g

升汞　　　　　　5.0g

蒸馏水　　　　　100mL

配制本液时，先将升汞溶于蒸馏水中、加温至40～50 ℃溶解后，再加入重铬酸钾，最后加入硫酸钠，贮存待用。使用前加入5mL冰醋酸，混合。组织块需固定12～24 h。切片染色前，须进行脱汞沉淀处理。

（4）Carnoy液　穿透能力强，能很好地固定胞浆和染色质，特别适合固定外膜致密的组织，在固定组织的同时能溶解大部分脂肪。此液亦使用于糖原及尼氏体的固定，对显示DNA及RNA效果较好。组织固定1～2 h即可。

无水乙醇　　　60mL

冰醋酸　　　　10mL

氯仿　　　　　30mL

（5）乙醇-醋酸-甲醛液（AAF液）　此液固定组织快，对脂质、糖类、蛋白质等物质有很好的固定效果，避免了三种固定液单独使用引起的组织收缩或膨胀，是一种优良的固定液。AAF固定液兼有固定和脱水作用，经固定的组织可直接移入95%乙醇脱水。

95%乙醇　　　　　85mL

醋酸　　　　　　 5mL

40%甲醛　　　　　10mL

-赖氨酸-多聚甲醛固定液（PLP）　此固定液较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。固定剂可有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。

A液：赖氨酸　　　　　　　　　　　　　　 1.827g

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　50mL

0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.4）　　　　50mL

B液：8%多聚甲醛水溶液　　　　　　　　　 100mL

本液临用时配制：取A液3份、B液1份，混合后，加入过碘酸钠，使液体终质量分数为2%。组织块在4 ℃下固定36～54 h。本液对细胞结构和抗原性保存较好。

（四）固定注意事项

1.根据研究目的的不同选择适当的固定剂。

2.接收标本及取材后，应及时固定组织，避免因固定延迟造成的组织干涸、腐败、自溶等现象。

3.固定组织时，根据组织大小选择合适的固定容器，要求容器的体积是组织的10～15倍，应选择瓶口较大的容器，便于标本的放入和取出。另外固定液要充足，一般为固定组织体积的10～20倍，至少为3～5倍。

4.固定时间要足够，组织大小不同，固定时间应有所不同，组织越大，固定时间越长；环境温度越低，固定时间也应适当延长，一般为3～24 h。

骨组织及钙化组织中含有大量钙盐，影响常规方法制作良好切片，须经过固定后去除钙盐使组织软化，才能进行常规切片，脱去钙盐的过程称之为脱钙。脱钙用的试剂为脱钙液。

（一）脱钙液的要求

1.脱钙完全。如果脱钙不完全则切片易撕开或碎裂并损伤切片刀。

2.不损伤组织细胞或纤维。

3.不妨碍以后的染色。

4.脱钙速度尽可能快。

（二）常用的脱钙液

1.甲酸-福尔马林液

甲酸　　　　　　　5～25mL

福尔马林　　　　　5mL

蒸馏水加至　　　　100mL

5%浓度甲酸是一种良好的脱钙液，速度适宜，组织损伤较小。25%浓度甲酸，脱钙速度明显增快，但组织损伤明显，可加入适量甲醛保护组织微细结构。

脱钙前将大块含钙组织制成0.5～1.0 cm组织片，加入脱钙液，一般2～4 d可完全脱钙。

2.Von ebner氏液

浓盐酸　　　　15mL

氯化钠　　　　7.5mL

蒸馏水加至　　100mL

盐酸脱钙液易使组织收缩，但速度较快,用氯化钠作为溶剂可效果良好，牙齿脱钙时盐酸质量分数可增至10%～20%。脱钙时每日应加盐酸0.5%直至完成脱钙。

3.硝酸脱钙液　是目前最为常用的脱钙液，缺点是易形成亚硝酸而使溶液呈色，产生颜色即迅速影响脱钙速度，且组织的黄染会影响随后的染色反应。在硝酸内加入0.1%尿素可以防止变黄，但尿素作用时间短暂,一旦硝酸显淡黄时即需要加入。

福尔马林　　　　　　　　　　　　　5mL

硝酸（定时加0.1%尿酸稳定）　　　　7.5～15mL

蒸馏水加至　　　　　　　　　　　　100mL

此配方中甲醛可抑制硝酸的浸软作用，这既具有脱钙作用，又具有固定作用。硝酸脱钙迅速而且使组织不膨胀，掌握好脱钙时间可直接脱水，不影响以后染色效果，脱钙完成后最好用流水洗去残余硝酸。

（三）脱钙注意事项

1.大块骨组织经固定后，锯成不超过1.0 cm厚的薄骨片，再以10%福尔马林固定后进行脱钙。骨组织过厚则须延长脱钙时间。长时间浸于强酸影响切片染色效果，故锯骨组织应尽可能薄。

2.在不影响临床诊断或科研的条件下，可将骨组织周围的软组织全部除去，如果切片目的在于切除观察骨髓病变或骨组织肿瘤，可除去一部分正常的致密骨组织，以利于脱钙和制片。

3.脱钙前最好先将骨组织进行脱脂。

4.脱钙要彻底，脱水应充分，在脱水过程中要注意不使其过度硬化。

5.脱钙完成后用流水冲洗24h以去除残留的酸液。

（四）脱钙效果的鉴定

1.最简单的方法是针刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力时，说明组织基本上脱钙完全，否则应继续脱钙。

2.用X射线检查组织内是否仍有钙残留。

3.化学实验检查:取5mL脱钙液用2 mol/L的NaOH（氢氧化钠）调整至中性,再加5%草酸钠或草酸铵1mL,液体浑浊表示有钙质，迟至5min仍不浑浊表示脱钙液中不含有钙质。

如组织中仍有钙质时,一定量的钙离子会溶于脱钙液中,游离的钙会干扰脱钙作用的完成。显然，应在每次试验时完全更换脱钙液，在试验中必须经过2～3 h间隔让钙溶解。

脱钙完成后继续进行常规脱水、透明浸蜡切片等步骤。

组织经过固定后进行洗涤。组织固定过程中残留固定液会影响到以后制片和染色，而有些固定液则在组织中可继续起到脆化组织的作用，以至于损坏组织，给制片工作带来不利。故应将组织内的固定液洗净，这一过程称之为洗涤。在洗涤过程中应根据固定液的不同选择合适的冲洗剂。

洗涤方法与注意事项：

1.水溶性的固定剂　常用的含水固定液是甲醛溶液，用流水冲洗即可。冲洗时将组织块放入广口瓶内，瓶口罩纱布并用线系牢，让水从瓶底向上缓缓流出。水洗时水流速度不能快，以免冲坏组织的完整性。小块组织冲洗时间为2～4 h，大块组织水洗时间约为4 h。固定时间长的组织块，水洗时间长些。对穿刺组织、脑等细小易碎的组织，以浸泡方式洗绦为宜，浸泡时应反复换水，浸泡时间应根据具体情况而定。

2.乙醇溶剂的固定剂　应用与固定剂浓度相近或低浓度的乙醇洗绦，不可用浓度相差太大的乙醇冲洗，也不能直接用水冲洗。

3.含苦味酸的固定剂　先用流水彻底冲洗，并用50%或70%的乙醇浸洗，以洗掉组织内苦味酸所留的黄色为止。

4.含有升汞的固定剂　组织经流水冲洗后，放入70%或80%的乙醇中洗绦，洗绦时滴入0.5%碘酒（用70%乙醇配制），待棕色消失后继续冲洗，直至脱汞乙醇无色。最后用5%硫代硫酸钠水溶液脱碘。

5.含有铬酸的固定剂　用流水冲洗12～24 h，组织在冲洗时最好置于暗处以免产生沉淀或使组织硬化而影响制片。

组织经过固定、洗涤后进行脱水。脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。所用的试剂称之为脱水剂。脱水剂必须是能与水在以任何比例相混合的试剂。

脱水的目的：水与透明剂二甲苯不相溶，脱水的目的就是便于更好的透明。

（一）脱水的基本原则

1.选择合适的脱水剂以保证组织中的水分完全脱净。

2.一般组织块大小1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm。

（二）常用的脱水剂

1.乙醇　是目前制片中最为常用的脱水剂，可与水以任何比例相混合，乙醇的脱水能力较强,而且能硬化组织。但是高浓度乙醇对于组织有明显的收缩作用。因此在以乙醇作为脱水剂时，应该先从浓度较低开始，然后递增其浓度这样可以避免组织过度收缩。

第1瓶乙醇浓度随固定剂、脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水从50%乙醇开始，如眼球、胚胎组织等。大多数组织标本则是从70%乙醇开始，再经80%、90%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ。脱水时间应视组织种类、大小、厚薄和固定剂的不同而异，一般2～4 h。但是有时为了某种特殊要求，为了防止糖原和尿酸结晶在水中消失要直接投入无水乙醇中固定，而不需要经过水洗和低浓度乙醇的脱水过程。经无水乙醇固定后的组织只需要再经过换一次无水乙醇脱水即可。

脱钙的骨组织、实质性脏器的脱水时间宜短；而疏松结缔组织、脂肪组织等脱水则宜适当延长。水分必须脱干净，脂肪必须溶去。含有铬酸的固定剂固定的组织，脱水时间不宜过长，而镀银组织更应注意脱水时间应比未镀银的同类组织要短。

2.丙酮　也是一种比较好的脱水剂。脱水能力强，速度快，可配制不同浓度进行脱水。但一般情况下，多用在无水乙醇的补充脱水。脱水顺序通常为：丙酮Ⅰ、丙酮Ⅱ、丙酮Ⅲ，每缸1～3 h。因脱速度快，不易褪去切片的颜色，故可用于甲基绿派洛宁染色的脱水，能较好显示DNA及RNA。丙酮脱水时间比乙醇快，但容易使组织过度硬化。所以应掌握脱水时间。

3.正丁醇　兼有脱水和透明两种作用，脱水能力较乙醇弱。可与水、乙醇相混合，而且也能溶解石蜡，因此正丁醇不仅可以替代乙醇使组织脱水，还可以代替二甲苯使组织透明，其最大优点是不易引起组织收缩与变脆。一般用法是：组织固定后，依次放入50%、70%、80%乙醇溶液中脱水，然后移入正丁醇处理12～24 h。正丁醇易挥发，吸入后引起头痛，故使用时应加以注意。

4.异丙醇　是乙醇的良好替代品，不含水，可替代无水乙醇。对组织的收缩、硬化作用较小。但价格较高，很少使用。此法不适用于火棉胶包埋法。

5.叔丁醇　叔丁醇是一种应用较广泛的脱水剂。能与水、乙醇、二甲苯相溶，是石蜡溶剂，故既有脱水作用又有透明作用。使组织收缩、变硬效果较小。脱水后组织经叔丁醇和石蜡1∶1混合液处理，可直接浸蜡不必透明。制作电镜观察的切片时，常用作中间脱水剂。

6.环已酮　能与苯、二甲苯、三氯甲烷等有机溶剂相溶，能溶解石蜡。不引起组织硬化。可代替无水乙醇脱水，不必经过二甲苯透明，可直接浸蜡。

自动脱水机：随着病理技术的发展，组织的人工组织脱水已逐步被自动组织脱水机取代，其最大的特点是能利用非上班时间进行处理组织，并能保证组织脱水、浸蜡、透明效果。使用前按照工作程序设置试剂先后顺序及浸泡时间，机器便可按照设定的程序工作，从而减轻了劳动强度。组织的处理时间依照组织块的大小、种类不同而设定，最好能依据组织块的性质和大小分类、分批进行处理。要定期检测试剂多少及浓度，及时更换试剂确保脱水、透明、浸蜡效果。

（三）脱水的注意事项

1.未经充分固定的组织不得进入脱水程序。

2.用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍。

3.自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。

4.脱水试剂应及时过滤、更换（500mL乙醇可用于500个组织块脱水，加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。

5.较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。

6.组织置于无水乙醇内的时间不宜过长，以免硬化。

7.丙酮脱水性能强，会使组织块收缩、变脆，不宜用以替代无水乙醇。

透明是指用某些化学试剂将组织中的脱水剂置换出来，以利于浸蜡及包埋，此时组织呈现半透明状态，故称透明。此过程所用到的试剂称之为透明剂。

（一）透明的目的

组织脱水后还要经过一个媒剂透明的过程，将脱水剂置换出来，目的是使石蜡（包埋剂）渗透到组织中去，以利于包埋。常用的脱水剂（如乙醇等）不能与包埋剂（如石蜡）相溶，因此，必须使用一种既可与脱水剂又能同包埋剂相溶的媒剂，即透明剂，在中间起到桥梁作用。

（二）常用的透明剂

透明剂有很多种，一般常用的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油等。

1.二甲苯　是最为常用的一种透明剂，它既能与乙醇、丙酮相溶，又是石蜡的溶剂。在透明过程中，可使组织继续硬化，由于二甲苯对组织的收缩性较强且作用迅速，因此，组织在二甲苯中时间不宜过长，以达到组织的透明为度，通常透明时间不超过2 h。小块组织0.5～1.0 h为宜。

2.苯和甲苯　与二甲苯相似，作用速度相对较缓，透明速度较慢，对组织收缩作用较小，不宜变脆，适用于致密结缔组织、肌肉等组织。苯和甲苯毒性较强，挥发快，故应注意安全使用。

3.氯仿　也是一种很好的透明剂，它的作用缓和，对组织硬化收缩作用不明显，组织在此液内过夜也不至于过硬变脆。但氯仿比重较大，折光率较小，不能改变组织的折光率，组织在氯仿中不易呈现二甲苯那样的透明现象。适用于大块组织的透明。

4.香柏油　易溶于乙醇，是乙醇脱水后的良好透明剂。其硬化作用极小，组织可在此液体内存放较长时间甚至长达数个月，经此处理后的组织容易切片。不过香柏油的浓度大、渗透力弱，同石蜡混合不及其他透明剂效果好，故常规石蜡切片一般不用。适用于致密结缔组织或较硬组织的透明。

5.苯甲酸甲酯　透明作用较弱，对组织硬化收缩作用较小。透明时间较为12～24 h。因其能溶于火棉胶，故常用于火棉胶切片的透明过程。

6.水杨酸甲酯　透明作用弱，硬化作用轻微，透明时间约为24 h，通常将水杨酸甲酯与苯甲酸甲酯以一定的比例混合使用，可用作骨组织的透明剂。

（三）透明的注意事项

1.脂肪组织由于其结构不同透明最快，但是这并不能说明组织中脱水剂已完全被透明剂取代，因脂肪组织本身折光率与透明剂相近，所以，应在透明剂中多浸一段时间，使脂肪组织尽可能被透明剂所溶解，才有利于浸蜡过程。

2.脑组织和有血块的组织应缩短在二甲苯内透明时间；而一些肌肉组织和胃肠组织则应该适当延长透明时间，最好先投入乙醇和透明剂等量混合液半小时，再投入透明剂，并更换一次透明剂，待组织完全透明后进行浸蜡，一般需要0.5～3 h。

3.二甲苯为有毒易挥发液体，使用过程中要注意，废旧的二甲苯不能随意丢弃，应交指定部门回收。

4.二甲苯必须保持无水，否则影响其透明程度。

5.透明过久是否会导致组织过度硬化变脆，取决于脱水的彻底与否，如果组织脱水完全彻底，则不会导致过度硬化和变脆。

组织经透明后，移入熔化的石蜡，被石蜡逐渐浸入组织间隙并完全取代透明剂，这一过程就叫浸蜡。其目的是使组织具有一定的硬度，有利于切片。其中石蜡就成为浸透剂，其他常用的浸透剂包括明胶、火棉胶、树脂等，他们既是浸透剂又是包埋剂。

（一）石蜡的要求

石蜡的质量和熔度与切片质量密切相关，用作浸蜡的石蜡不应含有水分、尘粒、杂质及其他异物，质地均匀呈半透明状，触之感觉滑而不腻，无结晶，颗粒少。石蜡中如有水分会结晶而变为白斑，可用加热搅拌的方法去除。将石蜡于小锅中加热煮至近沸，冷却再煮，反复数次后水分可以排除。挥发性油脂类在煮的过程中挥发。处置后的石蜡置于恒温箱中保持液体状态备用。所用的石蜡有一定的熔点和硬度。熔点高，硬度大。一般要求熔点在52～56 ℃，这既可以支持硬组织也可使切片成条。使用时应根据组织类型及制片时的温度和气候而异。夏季采用高熔点的石蜡，冬季则采用低熔点的石蜡。

（二）浸蜡时间

组织浸蜡时间也应视组织种类大小和结构不同而异。在整个浸蜡过程中，标本大小对完成浸蜡所需的时间有很大影响，较厚的组织需要较长时间才能使蜡完全浸入，而且厚的组织常因带入的透明剂较多，故需要多次浸蜡才能将透明剂除去，即使残存少量透明剂也会污染石蜡而产生结晶，导致切片时切片易碎裂。另外，也应考虑组织的种类如骨、皮肤和中枢神经系统等致密组织要比软组织如肝肾等需要加倍浸蜡时间；含血多的组织、肌肉和纤维束在蜡内易过硬而发脆，故浸蜡时间应相应缩短；疏松组织、脂肪、消化道组织等浸蜡时间可以适当延长。为了尽可能排除透明剂，浸蜡过程可以分两级或三级进行。以熔点较低的软石蜡作为第一步，然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步、第三步。浸蜡时间为1～4 h或更长，并使之过夜则较易切割。如此浸渍的组织切片在干燥箱内干燥也不易卷曲和碎裂。

（三）浸蜡注意事项

1.熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70 ℃）进行，不得用明火加温。

2.熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍。

3.组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。

4.浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。

5.熔蜡应及时过滤、更换。

将经过固定、脱水、透明、浸蜡的组织块从最后的浸蜡容器中取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片程序的进行。另外，常用的包埋剂还有火棉胶、明胶、树脂等。

（一）包埋的方法

有自动包埋机包埋和手工包埋两种。手工包埋的步骤如下：

1.先将熔融的石蜡倒入包埋盒中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下平正地放于包埋模具底面的中央处，埋入熔蜡。如有取自同一个体多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上包埋于同一蜡块内。腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋（立埋）。

2.将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧，使其牢固地贴在蜡块一侧，保证编号清晰可见。

3.待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移入冷水中加速凝固。

4.从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块，用刀片去除组织块周围的过多石蜡，以组织块周围保留1～2 mm石蜡为宜。将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。

5.把修整好的蜡块固定在支持器上，以备切片。

自动包埋机的使用方法按有关厂商的说明书操作。

（二）石蜡包埋的注意事项

1.应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号、块数和取材医师对包埋面的要求，准确地包入相应的病理号小条。发生包埋差错时，必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。

2.必须严防各种异物污染，勿将无关组织（包括缝线、纸屑或其他异物尤其是硬质异物）埋入蜡块内。

3.包埋过程要操作迅速，以免组织块在尚未包埋妥当前熔蜡凝固。

4.包埋用的熔蜡应纯净，熔点适宜。浸蜡Ⅰ用软蜡（熔点为45～50 ℃），浸蜡Ⅱ、Ⅲ和包埋用蜡均用硬蜡（熔点为56～58 ℃）。

5.包埋用熔蜡使用前应将先静置沉淀、过滤。

6.熔蜡时不得使用明火，以防燃烧。包埋用熔蜡的温度应<65 ℃；包埋用的镊子不可加温过高，以免烫伤组织。

组织包埋后，用切片机将蜡块切成薄片的过程，称之为切片。石蜡组织块能长时间保存，且操作简单，能切薄片，又能连续切片，可用于大批量制片，因此是病理诊断和科研中最为常用的切片方法。缺点是只能用于较小组织块，较大组织块不易切片，容易破碎。

优良切片技术需要熟练的技巧，这只有靠长期实践才可获得，需要技术工作者对器械的透彻了解和丰富的实践经验，优良的切片技术也是每一位病理技术工作者必备的技能。

石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片机，目前轮转式最为常用，切片厚度一般为3～5 μm。

1.修切蜡块　切片前应先修块，即切去周围过多的石蜡，一般留下约2 mm宽度为宜。蜡块留的太窄容易损坏组织；留的太多影响展片。修块前可在冰箱中冷冻一段时间。

2.切片用品的准备

（1）切片刀　切片前更换新的一次性切片刀或预先磨好切片刀。

（2）载玻片　准备足量载玻片（事先经清洗液、95%乙醇处理备用）。

（3）展片烤片仪　接入温水、接通电源，调整温度。

（4）其他用品　准备好毛笔、记号笔、镊子、冰块等。

3.切片制作过程　旋转式切片机操作步骤如下。

（1）将切片刀装在刀架上，后将蜡块装在切片机固定装置上。调整蜡块与刀至合适位置（刀刃与蜡块切面呈5°夹角）。

（2）先用较大进刀量粗切蜡块，将组织最大面暴露。对小标本不要修切太多，以免将整个组织切掉。

（3）左手持毛笔，右手旋转切片机旋转轮，连续旋转切除蜡带，左手持毛笔将蜡带下端轻轻托起，右手用镊子夹起蜡带上端，正面朝上放入展片仪水盒中（温度一般保持45 ℃左右），待蜡带中组织展平后，即可进行分片和捞片。

（4）捞起切片后，写上编号。捞片时注意切片的位置，一般将切片的中心位于载玻片右侧1/3与2/3交界处为佳，并注意整齐美观。

（5）放入烤箱（60 ℃左右）烘烤切片30～45min，应注意有凝血块和皮肤组织应及时烤片，温度应稍低；脑组织切片捞出后直立晾干，再烤片，否则容易产生气泡。

思考题

1．常用的固定液有哪些，适用条件是什么？

2．如何将子宫肌瘤标本制成病理切片？

学习目标

◆熟悉快速冰冻切片技术的适应证及禁忌证。

◆会制快速冰冻切片及染色。

◆熟悉快速冰冻切片的质量控制。

任务描述

快速冰冻技术是在低温下使组织迅速冷却达到一定的硬度，然后进行切片诊断的技术方法，因其操作快捷、简便，现已广泛应用在手术中快速病理诊断，方便手术医师制订手术方案。

手术中快速冰冻检查是临床医师在实施手术过程中，为明确疾病诊断制订合理手术方案请求病理医师的紧急会诊，需要临床医师与病理医师间的密切合作。

术中快速冰冻检查要求病理医师在很短时间内，根据对切除标本和组织块快速冷冻切片的检查，向手术医师提供参考性病理诊断意见。与常规石蜡切片的病理诊断相比，快速活检会诊具有更多的局限性和误诊的可能性。有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。因此，应向临床医师说明快速活检的局限性、适用范围、慎用范围和不宜应用范围。

（一）适用范围

1.需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的标本。

2.了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。

3.确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织残留。

4.确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。

（二）慎用范围

涉及截肢和其他会严重致残的根治性手术切除的标本。需要此类手术治疗的病人，病变性质宜于手术前通过常规活检确定。

（三）不宜应用范围

1.怀疑为恶性淋巴瘤。

2.送检标本过小，一般要求标本长径≥0.2 cm。

3.术前易于进行常规活检者。

4.脂肪组织、骨组织和钙化组织。

5.需要依据核分裂象计数判断良、恶性的软组织肿瘤。

6.主要根据肿瘤生物学行为特征而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤。

7.已知具有传染性的标本，例如结核病、肝炎、艾滋病等。

（四）快速活检告知与申请

1.相关临床科室医师应于手术前向病人或病人家属说明快速活检的意义和局限性等，取得病人或者家属的知情和理解。并在由医院制定的《手术中快速活检患方知情同意书》签署意见和签名。

2.临床医师应在手术前一天向病理科递交快速活检申请单，并详细填写病人的病史，重要的影像学、实验室检查结果和提醒病理医师需要特别注意的问题等。尽量避免在手术进行过程中临时申请快速冰冻检查。

（五）病理科的准备

1.手术中快速活检应由经过该项工作训练的主治医师以上的病理医师主持。尚不具备相应条件的病理科不应勉强开展手术中快速活检。

2.负责快速活检的主检病理医师应了解病人的各种信息如临床情况、手术所见、既往有关的病理学检查情况。

3.手术当天至少应于切片前1 h打开冰冻切片机进行预冷，温度一般为-20～-15 ℃。常规开展冷冻切片快速病理学诊断的病理科，恒冷箱切片机宜处于24 h恒温待机状态。

快速冰冻切片根据冰冻切片机的不同可分为：恒温箱冰冻切片机、半导体冰冻切片机、二氧化碳冰冻切片机。

（一）冰冻切片制作

一般流程为：取材→（固定）→组织速冻→冰冻切片→贴片→染色。下面根据冰冻切片机的不同介绍其具体操作步骤。

1.恒温箱冰冻切片机

（1）取材　应由主持快速活检的病理医师亲自参与。通常选取具有代表性的病变组织1～2块，如有需要可适量增加取材块数。取材组织应薄，一般不超过2 mm。

（2）组织速冻　将取材的组织放置在滴有包埋剂的冰托上使组织速冻，组织要尽量放平整。

（3）切片　将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10 μm。用毛笔将切片展开，贴附于载玻片上，稍干后，置于冷冻切片固定液中固定1min，随即进行HE染色。也可用毛笔将切片托入水中，再用玻璃弯针将切片移至染色皿中进行染色。

2.二氧化碳制冷切片

（1）取材　取材应由主持快速活检的病理医师亲自参与。通常选取具有代表性的病变组织1～2块，如有需要，可适量增加取材块数。取材组织应薄，一般不超过2 mm。

（2）包埋　将取材的组织放置在滴有包埋剂的冰托上，组织要尽量放平整。

（3）切片

1）将组织块放在冷冻台上，滴加OCT（聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物）或羟甲基纤维素液于组织块周围（将组织块包埋），使固定在切片机上的切片刀接近组织块表面。

2）间断开放液态二氧化碳桶的开关，喷冻组织块和切片刀，使组织块冻结和切片刀制冷。

3）迅速移动切片刀进行切片，先将组织块修平，然后调节厚度至8～12 μm处进行切片。

4）用毛笔将切片展开，贴附于载玻片上，稍干后，置于冷冻切片固定液中固定1min，随即进行HE染色。也可用毛笔将切片托入水中，再用玻璃弯针将切片移至染色皿中进行染色。

5）组织块也可先在4%中性甲醛中煮沸固定1min，水洗后再行冷冻切片。

3.半导体制冷切片

（2）包埋　将取材的组织放置在滴有包埋剂的冰托上，组织要尽量放平整。

（3）切片