法测定血清总补体活性

实验二　CH₅₀法测定血清总补体活性

实验目的

（1）掌握CH50法测定总补体活性的原理及方法。

（2）了解本实验的用途。

实验原理

绵羊红细胞（sheep red blood cells，SRBC）与相应的抗体（溶血素）结合后，可激活待检血清中的补体而导致SRBC溶血。补体含量与溶血程度呈S形曲线正相关。当溶血程度接近100%时，补体量的变化对溶血的程度影响不大，而溶血程度在30%～70%时，只要补体量稍有变化，就可对溶血程度产生很大影响，因此以产生50%的溶血所需补体的量作为一个CH₅₀单位。人血清总补体活性正常值为50～100CH₅₀U/mL。

CH₅₀实验方法简便，但需要时间较长，且敏感性较低，补体的溶血活性与反应体系的pH值、离子浓度、反应温度等有关。SRBC浓度与补体溶血活性亦有关。因此在进行实验时需对反应的各个环节进行严格控制。

实验材料

（1）待检新鲜血清，作1∶20稀释。

（2）5%SRBC悬液。

（3）溶血素（抗SRBC抗体），一般为3个U。

（4）致敏SRBC：5%SRBC加等量溶血素，置于37℃水浴10min。

（5）缓冲液：取NaCl 75．00g，1mol/L HCl 177mL，三乙醇胺28．00mL，MgCl₂·6H2O 1．00g，CaCl₂·2H2O 0．2g。先将NaCl溶于700mL蒸馏水中，再加入HCl和三乙醇胺。将MgCl₂·6H₂O和CaCl₂·2H₂O分别用2mL蒸馏水溶解后，逐一加入，再用蒸馏水定容至1L，于4℃保存。临用前取上述溶液1份加9份蒸馏水。

（6）离心机、试管、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、比色杯等。

实验方法

（1）50%溶血标准管的配制：取5%SRBC悬液0．5mL，置于刻度离心管内，2 000 r/min离心10min。弃去上清液后加蒸馏水至2．0mL，使其全部溶血。加2．0mL 1．7% NaCl缓冲盐水混匀，恢复等渗，加入5%SRBC 0．5mL，混匀后与其他试管一起温育。

（2）取洁净试管10支，依次编号，排在试管架上。

（3）按照表1－1加入各试剂，混匀，将试管置于37℃水浴30min。

表1－1　CH₅₀法测定总补体活性操作表

（4）2000r/min离心5min后与50%溶血标准管比较，判定结果。

实验结果

将50%溶血标准管与各测定管进行初步目视比色，选择与标准管颜色相近的两管，也可于721分光光度计上在波长542nm处测OD值，选择最接近50%溶血标准管OD值的一管，根据此管中加入的血清量和血清稀释倍数计算出50%溶血的总补体值。

CH50（U/mL）＝1/引起50%溶血管的血清用量（mL）×稀释倍数。

注意事项

（1）待检血清必须新鲜，如放置于室温2h以上，可使补体活性下降。

（2）试管口径大小一致，清洁透明，便于观察。

（3）50%溶血标准管配制必须用同批实验用绵羊红细胞，并同时放入冰箱。

（4）补体性质不稳定，所以需对实验的条件和各个环节加以严格控制。

思考题

（1）何谓一个CH50单位？何谓溶血素？

（2）如何计算每毫升血清所含的CH50单位数？