第三十九章抗胰蛋白酶缺乏症的遗传学和

第三十九章　抗胰蛋白酶缺乏症的遗传学和 发病机制

一、前言

正常的肺组织受到一系列抗蛋白酶的保护，使其免受蛋白酶的攻击。这些抗蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶抑制物，如α1－抗胰蛋白酶（α1－antitrypsin，α1－AT）、α1－抗胰凝乳蛋白酶（α1－antichymotrypsin）、分泌性白细胞蛋白酶抑制物（secretory leucoproteinase inhibitor，SLPI）、金属蛋白酶组织抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）以及半胱氨酸蛋白酶抑制物等。随着对遗传性α1－AT缺乏症致肺气肿的逐渐认识，抗蛋白酶缺乏在其他肺部疾病发病机制的作用也越来越受到关注，如支气管扩张症、哮喘和韦格纳肉芽肿等。蛋白酶抑制物缺乏与肺组织损伤、破坏之间存在着明显的关联，因此有学者提出了蛋白酶－抗蛋白酶平衡学说。正常情况下，蛋白酶和抗蛋白酶之间存在着一种微妙的平衡，一旦这种平衡被打破，蛋白酶就会对肺组织产生破坏、损伤。许多动物试验都证实了这一学说：当向啮齿动物的肺内滴注蛋白酶如木瓜蛋白酶、猪胰蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、组织蛋白酶B以及蛋白酶3后，这些动物都随后发展为肺气肿。同样的，在离体情况下中性粒细胞的组织蛋白酶G也引起支气管壁的弹性蛋白分解。蛋白酶－抗蛋白酶平衡学说包括一系列的蛋白酶和抑制物（表39－1），也和许多其他肺部疾病有关，如非α1－AT缺乏的肺气肿、肺囊性纤维化、急性呼吸窘迫综合征、肿瘤转移和慢性肺部感染。

表39－1　人肺组织中常见的蛋白酶和相应的抗蛋白酶

（续　表）

最近几年，抗蛋白酶的结构、功能以及失活机制被进一步阐明。到目前为止，还未发现SLIP，TIMP或半胱氨酸蛋白酶抑制物等发生基因突变引起抗蛋白酶缺乏，因此本文主要对丝氨酸蛋白酶抑制物α1－A T的遗传及发病机制做进一步阐述。

二、丝氨酸蛋白酶抑制物的结构

丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins）是一个庞大的蛋白酶抑制物家族，超过90个成员，且与α1－A T有30%以上的同源性，包括α1－A T、α1－抗胰凝乳蛋白酶、抗凝血酶、C1－抑制物、抗纤维蛋白溶酶、纤维蛋白溶酶原激活抑制物－1（PAI－1），以及一些不具有抑制作用的蛋白，如氢化可的松结合蛋白、甲状腺素结合蛋白、血管紧张素原、卵蛋白等。作为serpins家族的一员，α1－A T由一个保守的三级结构——9个α－螺旋围绕3个β^－折叠结构组成，包括一条A－β折叠及其他两条β折叠（B和C）和一个抑制活性中心环。X线晶体结构分析表明serpins的活性中心环是可变的，又称为可迁移性反应位点环（reactive site loop，RSL），它具有许多不同的形态。RSL与目标酶的底物结合中心的空间结构互补，长度约为20个氨基酸残基，具有丝氨酸蛋白酶天然底物的许多特征，如氨基酸顺序、表面连接特性、柔韧性等。

活性环的可变性在serpins的抑制机制中起着重要作用，它就好像捕鼠器一样。活性环的P₁－P′₁键对目标蛋白酶来说就好像“多肽诱饵”或是奶酪。多肽诱饵的不同决定了目标蛋白酶的不同，也决定了蛋白酶抑制物的特异性。例如，α1－A T的P₁－P′₁键是蛋氨酸－丝氨酸残基，因此主要抑制人中性粒细胞弹性蛋白酶；α1－抗胰凝乳蛋白酶是亮氨酸－丝氨酸残基，主要抑制组织蛋白酶G；抗凝血酶是精氨酸－丝氨酸残基，主要抑制作用于凝血过程的酶，如凝血酶、凝血因子a。

三、α1－AT的功能和作用机制

α1－A T是最主要的循环蛋白酶抑制物，是由394个氨基酸组成的急性时相蛋白（acute phase protein），编码于第14号染色体的q31～32.1区。它主要由肝细胞、巨噬细胞、小肠和肺上皮细胞等分泌，分子量为52×10³，血循环中的浓度为1.9～3.5mg/ml。α1－抗胰蛋白酶首先命名是因为其抑制胰蛋白酶的能力，但随后发现它对一系列的蛋白酶均有很强的抑制作用，如中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3。由于其广泛的抑制蛋白酶谱，它又被称为α1－蛋白酶抑制物。血循环中90%的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）与α1－AT以1∶1的比例结合形成NE－α1－AT复合物而失去活性，然后被网状内皮系统清除。

α1－AT抑制蛋白酶的过程是一个自毁模式的反应过程，α1－AT除了被其捕获的蛋白酶缓慢裂解外，同时α1－AT－蛋白酶复合物能被吞噬细胞识别、吞噬，从血浆中清除。α1－AT捕获目标酶，并与目标酶结合形成α1－AT－蛋白酶1∶1的共价复合物，蛋白酶对结合的α1－AT产生缓慢的酶解。RSL被蛋白酶裂解后产生的新C－末端作为新的β^－折叠肽段插入A－β^－折叠成为A－β^－折叠的中心肽段（s4A），同时产生的约5个氨基酸长度的新的N－末端成为C－β^－折叠的独立第1肽段。RSL裂解后产生的氨基酸位置重排，使α1－AT构象由S型向R型转化，封闭了蛋白酶的反应中心从而达到抑制蛋白酶活性的作用。

当RSL上的氨基酸发生变异时，α1－AT的蛋白酶抑制活性亦将发生改变。α1－AT的蛋白酶抑制活性中心靠近C－末端的第358～359位的蛋氨酸－丝氨酸残基（Met－Ser），位于α1－AT分子表面的RSL上。当第358位的Met被吞噬细胞释放的氧基氧化或吸烟等环境污染剂氧化时，α1－AT将失去蛋白酶抑制活性。

四、α1－AT基因突变

α1－AT为常染色体遗传，与α1－抗胰凝乳蛋白酶、蛋白C抑制剂、皮质类固醇结合球蛋白等多种蛋白的遗传基因共同组成一个长度为370kb的serpins基因组。α1－AT的血浆蛋白浓度主要由等位基因的表达而决定。α1－AT的基因突变会导致蛋白质的缺乏、减少或功能异常，常见的α1－AT正常和缺乏的基因型如表39－2所示。

表39－2　α₁－AT正常和缺乏的基因型和表现结果

（续　表）

根据α1－A T在酸性电泳中的迁移特征分为不同的遗传表现型，Pi M M遗传型占绝大多数，表现为正常的血浆α1－A T水平。Z，S型为最常见的两种变异型，其中95%以上属于Z型变异，两种变异型相对于M型呈显性遗传，无论是纯合子还是与M型的杂合子，或多或少地都将表现出遗传性血浆α1－A T水平低下的现象。S型α1－A T为264位的谷氨酸（Glu）被缬氨酸（Val）替代（²⁶⁴ Glu→Val），这种基因突变在来自伊比利亚半岛的欧洲人中高达28%以上，PiSS纯合子个体血浆中的α1－A T水平是正常Pi M M水平的60%。虽然PiSS不出现临床的遗传表现，但S等位基因与p－抗中性粒细胞胞质抗体（p－A NCA）阳性血管炎的发生有关。PiZS杂合子的血浆水平为正常的37%（30%来自S型，7%来自Z型），具有发展为肺气肿的危险性。Z型α1－A T为342位的谷氨酸（Glu）被赖氨酸（Lys）替代（³⁴² Glu→Lys），PiZZ纯合子在欧洲人中的比例为1/2 000，其α1－A T血浆水平只有正常的10%～15%。Z型突变可引起肝细胞内质网中α1－A T的集聚，从而导致儿童性黄疸、肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌。由于血浆α1－A T水平降低，肺组织缺乏保护而受到的蛋白酶的攻击和破坏，因此容易引起早期发生的全小叶型肺气肿、支气管扩张、血管炎和哮喘等。但也有些Z型突变严重干扰了蛋白质的折叠，或使未成熟的α1－A T多肽截断，然后蛋白质在内质网被降解，因此这种突变不表现肝细胞的损害，只是发生早发性原发性肺气肿。M和Z型的杂合子（PiMZ）的α1－A T血浆水平为正常的57%（50%来自M，7%来自Z），但发生肺气肿的危险性现在还不清楚。

五、基因突变时α1－AT的形态

Z型α1－A T为342位的Glu被Lys替代，而S型α1－A T为264位的Glu被Val替代。342 Glu为RSL的可折叠部位，通过与A－β折叠结构形成盐桥，使RSL的肽段345～350向A－β折叠结构的s3 A与s5 A间的间隙嵌入。当342 Glu被替代后，干扰了盐桥的形成，肽段345～350不能向A－β折叠结构嵌入，令A－β折叠结构的s3A与s5A间的间隙暴露，暴露的间隙区吸引了另一个α1－A T分子的相应肽段的嵌入，α1－A T分子逐一嵌入形成聚合体在肝细胞内质网上沉积。因此盐桥的破坏是导致Z型α1－A T在肝细胞内质网上沉积的重要原因。

Z型突变的α1－A T由于一个分子的RSL插入另一分子A－β折叠结构中，然后逐一嵌入其他α1－A T分子，形成聚合体而在肝细胞内质网上沉积。因此在Z型突变的血浆中可发现高分子量的聚合体，而M型纯合子中则没有。进一步的离体研究还发现Z型突变的α1－A T很不稳定，在一定的生理条件下容易形成环－折叠聚合体，并呈温度和浓度依赖性。当温度上升到41℃，则加速聚合体的形成；而加入外源性的活性环肽链，由于和突变α1－AT竞争A－β折叠结合位点，可以阻碍聚合体的形成。而且离体形成的聚合体具有与从PiZZ中分离的聚合体相同的电镜结构。

除了Z型突变，还有其他两种突变型可产生α1－AT的缺乏和肝脏病变：S_liyama和MMalton型突变。S_liyama型突变（⁵³Ser→Phe）在欧洲没有报道，但恰是在日本引起α1－AT缺乏最常见的类型。MMalton，MNichinan和MCagliari型突变均源自52Phe缺失的点突变，这几种类型在高加索人群中有散发的报道。S_liyama和MMalton突变位于开闭区，控制着A－β折叠的开放和活性环的插入，因此也能形成环－折叠聚合体。环－折叠聚合体的形成可导致α1－AT的轻度缺乏，但聚合体的形成速率明显低于Z型突变，因此其临床表现和肝内聚合体的阻塞较轻。

不同的α1－AT突变可以引起相似的临床表现、相似的α1－AT形态改变和肝脏病变。这些α1－AT突变型可能在肝细胞中具有相同的降解通路，因此导致肝内聚合体的阻塞，从而引起新生儿肝炎、青少年肝硬化和肝细胞肝癌。即使在PiZZ纯合子突变（³⁴² Glu→Lys）患者中肝脏病变的严重程度也有很大差异，这可能与聚合体形成的速率呈温度和浓度依赖性有关。当炎症时，温度上升，α1－AT作为急性时相反应蛋白分泌增加，这些因素都会加速聚合体的形成，以致加重肝脏病变。除此之外，还有其他基因影响Z和S型α1－AT在肝脏内质网合成的过程。

目前发现环－折叠聚合体的形成在serpins家族中是普遍现象，如C1－抑制物、抗血栓素和α1－抗胰凝乳蛋白酶的基因突变产物均能产生环－折叠聚合体。在非洲蟾蜍卵母细胞中通过突变基因定位和蛋白表达的方法证实了聚合体形成与基因突变的关系。在A－β折叠开放区域的点突变（⁵¹Phe→Leu）能稳定α1－AT分子，减轻Z型α1－AT在离体和活体中的作用，而且这种突变能完全抑制S_liyama型α1－AT的聚积。

通过对Z型α1－AT结构的分析，产生了一个新的想法，即设计一种药物能阻止环－折叠聚合体的形成，从而增加α1－AT从肝脏的释放，减轻肝脏病变，增加循环中血浆α1－AT的浓度。

六、环折叠聚合体与肺气肿

α1－AT缺乏性肺气肿目前认为主要是由于血浆α1－AT的浓度下降，不能保护肺组织免受蛋白酶的攻击。PiZZ患者中α1－AT的浓度不能保护肺组织抵御丝氨酸蛋白酶的破坏，而且其P1蛋氨酸残基很容易受到氧化而失活。Z型α1－AT的产物环－折叠聚合体在肺组织中也可能发生，有学者测定了5例PiZZ患者的支气管肺泡灌洗液（BALF），其中有2位患者发现了聚合体，而在13例MZ、MS和MM型α1－AT对照组中没有发现一例。Z型α1－AT聚合体由于活性环插入A－β折叠而隐藏起来，使得其失去了抑制蛋白酶的活性。目前已逐步明确Z型α1－AT聚合体与肺内过度的中性粒细胞浸润、感染和肺功能下降均有一定关系。Z型α1－AT所致肺气肿是全小叶型，而α1－AT正常吸烟所致肺气肿是小叶中央型较多，这种差别可能也与α1－AT聚合体有关。

七、吸烟者与α1－AT失活

Z型突变α1－AT缺乏症引起的肺气肿只占所有肺气肿患者的1%～2%，绝大部分患者是由吸烟所致。吸烟能促使肺泡巨噬细胞释放中性粒细胞趋化因子，刺激中性粒细胞释放大量的弹性蛋白酶。另外，烟草中所含有的氧化剂和中性粒细胞活化释放的氧化剂可以氧化α1－A T的活性中心“³⁵⁸蛋氨酸”残基，从而抑制α1－A T的活性。由此造成蛋白酶－抗蛋白酶系统失衡，下呼吸道过多的游离弹性蛋白酶对肺间质不断产生破坏，最终出现明显的肺气肿并引起临床症状。因此在血浆α1－A T正常吸烟者的BA LF中可测定到失活的α1－A T。

八、先天性α1－AT缺乏症的治疗

先天性α1－A T缺乏症是美国和欧洲最常见的致死性遗传病之一，其特征为血清α1－A T水平明显减低，在30～40岁前发生肺气肿的概率甚高。美国有200万人患肺气肿，而α1－A T缺乏者有2万～4万人，占1%～2%。1981年Gadek等提出以α1－A T替代治疗提高血清α1－A T水平的方法矫正α1－A T缺乏。1985年Wewers等在美国国立心肺和血液研究中心应用提纯的人血清α1－A T治疗21例α1－A T缺乏患者（60 mg/kg，每周1次，共治疗6个月）。结果血清α1－A T含量由30±1 mg/dl升高到126±1 mg/dl，血清抗蛋白酶活性由5.4±0.1μmol/L升至13.3±0.1μM，但肺功能未见明显改善。1988年α1－A T替代疗法矫治α1－A T缺乏症获得了美国卫生机构批准。1997年Schwaiblmair等对20例应用α1－A T替代治疗的严重α1－A T缺乏患者进行了长达3年的疗效观察，第1秒用力呼气容积（FE V1.0）由治疗前的1.35±0.12 L降至1.25±0.12 L，FEV1.0的年下降率为35.6毫升/年，低于一般文献报道的肺气肿患者FEV1.0的年下降值，而其他肺容量和通气功能指标如用力肺活量（F V C）、呼气最大流速（M EF）、残气量（R V）和肺总量（T LC）均无明显改变，因此α1－A T替代治疗能够减缓α1－A T缺乏患者肺功能的下降。但α1－A T替代疗法的费用是非常高的，平均每人每年约2万～3万美元。1991年Hay等对α1－A T替代疗法的成本－效益比进行了研究，认为α1－A T替代疗法有明显的经济效益。目前，美国心肺和血液研究中心正在进行大样本（约1 000例）、前瞻性的对照研究，相信能对替代疗法做出正确的评价。

九、小结

α1－A T缺乏主要是由于环－折叠聚合体在肝细胞的内质网中积聚，从而分泌至血循环减少所致。环－折叠聚合体形成的速率与血浆缺乏的程度、肝脏病变的严重程度密切相关，Z型，S_liyama和M Malton型是最常见的3种基因型。Z型聚合体也在肺组织内形成，使α1－A T失活，进一步降低的肺组织中的抗蛋白酶活性。正常吸烟者中α1－A T活性中心的氧化失活，在吸烟所致肺气肿的发病机制中起着重要作用。目前α1－A T替代疗法是矫治α1－A T缺乏症最常用而有效的方法。

（揭志军）

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