（一）高铁血红蛋白还原试验
【原理】在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白转变成高铁血红蛋白，正常红细胞的G-6-PD催化戊糖旁路使NADP转化成 NADPH，其脱的氢通过亚甲蓝的递氢作用使高铁血红蛋白（Fe3+）还原成亚铁血红蛋白（Fe2+），通过比色测定高铁血红蛋白含量，观察其还原率。当G-6-PD缺乏时，由于NADPH生成减少或缺乏，高铁血红蛋白不被还原或还原速度减慢，使高铁血红蛋白还原率下降（图9-11）。
【试剂】
1. 0.18mol/L 亚硝酸钠（含5%葡萄糖）溶液。
2. 0.4mmol/L亚甲蓝溶液。
4. 反应液：0.18mol/L 亚硝酸钠（含5%葡萄糖）溶液1份加0.4mmol/L亚甲蓝溶液1份，充分混合。
图9-11 高铁血红蛋白还原试验示意图
【操作】
1.采静脉血1.8ml，加0.109mol/L枸橼酸钠抗凝剂0.2ml，混匀，加入20mg葡萄糖，混匀后以转速1000r/min，离心5min，调整血细胞与血浆比例为1:1后再混匀。
2.取混匀血标本1ml，加反应液0.1ml，颠倒混合15次，使之与空气中的氧充分接触。
3.加塞后37℃水浴3h，同时将以上未加反应液的血标本放于37℃水浴3h。
4.取孵育后混匀的标本0.1ml，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液10ml，混匀放置2min，选波长635nm，以磷酸盐缓冲液调零，用分光光度计测定吸光度为SA。
5.同样取未加反应液的孵育标本0.1ml，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液10ml，混匀放置2min，用分光光度计测定吸光度为B。再加入亚硝酸钠葡萄糖混合液1滴，混匀后放5min，再测定其吸光度为St，此为高铁血红蛋白对照。
6.计算：
【注意事项】
1.标本不应有凝血、溶血。
2.不能用草酸盐抗凝，可用肝素或ACD抗凝，ACD抗凝时，与血之比为0.15:1。
3.血细胞比容过低（<30%）时，高铁血红蛋白还原率显著降低。故注意将血细胞比容调整到35%～40%。
【参考值】正常人高铁血红蛋白还原率≥75%（脐带血≥77%）。
【临床意义】蚕豆病和伯氨喹型药物溶血性贫血等患者，由于G-6-PD缺乏，高铁血红蛋白还原率下降。中间缺乏（杂合子）为31%～74%，严重缺乏（半合子或纯合子）<30%。
（二）变性珠蛋白小体生成试验
【原理】G-6-PD缺乏者的血标本加入乙酰苯肼于37℃孵育2～4h，乙酰苯肼可使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，高铁血红蛋白解离成高铁血红素和变性珠蛋白。变性珠蛋白聚合成变性珠蛋白小体，附于红细胞膜上，经煌焦油蓝活体染色，观察红细胞中变性珠蛋白小体的情况。
【试剂】
1.1g/L乙酰苯肼溶液：乙酰苯肼2mg加pH7.4 PBS缓冲液2ml。
2.10g/L煌焦油蓝盐水溶液：取1.0g煌焦油蓝，溶于109mmol/L枸橼酸钠20ml中，加生理盐水至100ml，过滤后贮于棕色瓶内。
【操作】
1.取0.1ml肝素抗凝血加入2ml乙酰苯肼溶液，混匀，37℃水浴4h。
2.取0.5ml孵育后的红细胞混悬液加0.5ml煌焦油蓝盐水溶液，混匀37℃染10min。
3.取上述标本推片，在油镜下观察红细胞。含变性珠蛋白小体的红细胞是在红细胞内出现多个紫蓝色，大小不均，形状不规则的颗粒（图9-12）。
4.计数1000个红细胞，计算含5个以上变性珠蛋白小体的红细胞百分率。
5.同时取正常人血标本按以上方法检测作为正常对照。
【注意事项】
1.不稳定血红蛋白病也可出现变性珠蛋白小体，但其形态呈单一的圆形或椭圆形粗大颗粒，附于红细胞膜或突出在红细胞膜外，注意同网织红细胞区别。
2.乙醚苯肼液应保存在4℃的冰箱中。
【参考值】正常人含5个及以上变性珠蛋白小体的红细胞一般<30%。
【临床意义】
1.G-6-PD缺乏症含变性珠蛋白小体的红细胞阳性率>45%，故可作为G-6-PD缺乏的筛选试验。但还原型谷胱甘肽缺乏症时也增高，不稳定血红蛋白病含变性珠蛋白小体细胞为75%～84%，HbH病和化学物质中毒时也可增高。
2.变性珠蛋白小体主要是α、β珠蛋白链的病变而引起的溶解度和稳定性降低所致，是一种变性血红蛋白颗粒，附于红细胞膜上，故又称血红蛋白包涵体。多见于药物或接触化学物质后引起血红蛋白变性，也见于不稳定血红蛋白病患者。该试验与异丙醇试验、热不稳定试验等用于不稳定血红蛋白的诊断。
（三）G-6-PD荧光斑点试验
【原理】根据G-6-PD可催化葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）和NADP，形成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，NADPH在长波紫外光（265～365nm）照射下可发出荧光。G-6-PD活性越强，荧光越强，G-6-PD缺乏时，不出现荧光。
【试剂】
1.0.01mol/L葡萄糖-6-磷酸液：3.05mg葡萄糖-6-磷酸钠盐溶于1ml蒸馏水。
2.7.5mmol/L NADP液：取NADP 6mg溶于lml 蒸馏水。
3.0.25mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：取80ml 0.25mol/L K2HPO4和20ml 0.25mol/L KH2PO4混合，调节pH为7.4。
4.1%皂素。
5.反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀，于-20℃可保存2年，-4℃保存数月。
图9-12 红细胞内变性珠蛋白小体
【操作】
1.取10μl全血或15%红细胞悬液加入100μl的反应液，充分混匀，取一小滴混合液滴于滤纸上（第一斑点）。
2.将上液置于37℃ 水浴10min，再取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）。
3.晾干后，在长波紫外灯下（365nm）观察结果。
【注意事项】
1.检测的第一点作为实验对照应无荧光或弱荧光出现。
2.每次试验应用正常标本（已知G-6-PD正常），做阴性对照。
3.如贫血严重取血量相应加大，或用红细胞混悬液进行试验。
4.为提高敏感性可在反应液中加入1份8.0mmol/L GSSG（氧化型谷胱甘肽）。因在杂合子患者的标本中残余有G-6-PD，反应后可产生少量NADPH，GSSG存在可将其再氧化为NADP。
【参考值】 10min时，正常人第二斑点出现强荧光。
【临床意义】G-6-PD缺乏杂合子出现弱荧光（第二斑点与第一斑点比较无明显变化），G-6-PD严重缺乏者无荧光。
（四）丙酮酸激酶荧光斑点试验
【原理】丙酮酸激酶（PK）在二磷酸腺苷（ADP）存在的条件下催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化成丙酮酸，在LDH作用下丙酮酸转化为乳酸，同时NADH（有荧光）氧化为NAD（无荧光）（图9-13）。在长波紫外线照射下检测荧光消失的时间可反映PK的活性。
图9-13 丙酮酸激酶荧光斑点试验示意图
【试剂】
1.0.15mol/L PEP液 取144.3mg PEP溶于2ml蒸馏水中，用0.2mol/L的NaOH液调节pH为7～8，冷藏备用。
2.0.015mol/L NADH液 NADH液10.5mg，溶于1ml蒸馏水中，并用0.2 mol/L的NaOH液调pH为7～8，冷藏备用。
3.0.08mol/L硫酸镁溶液 MgSO4·7H2O 98mg溶于5ml蒸馏水中。
4.0.25mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取80ml 0.25mol/LK2HPO4和20ml 0.25mol/L KH2PO4混合，调节pH为7.4。
5.0.03mol/L ADP液 取ADP二钠盐150mg溶于5ml蒸馏水，用0.2mol/L的NaOH液调节pH为7～8，冷藏备用。
6.反应液（临用新配） 0.15mol/L PEP30μl，NADH液0.1ml，0.08mol/LMgSO4溶液0.1ml，0.25mol/L磷酸盐缓冲液0.05ml，0.03mol/LADP液0.1ml，蒸馏水0.62ml，混匀待用。
【操作】
1.取肝素抗凝血2ml，经转速1000r/min，离心5min，弃去血浆和白细胞、血小板层，用生理盐水洗涤红细胞3次，取1份压积红细胞加4份生理盐水配成20%的红细胞悬液。
2.配制好的红细胞悬液放于-20℃ 以下冷冻，再在室温中复融，使红细胞溶解。
3.用小试管取反应液200μl，加上述溶血液20μl，充分混匀，于37℃温育。
在温育开始时和温育后25min、35min、45min和60min分别取一小滴混合液点于滤纸上，晾干后，在紫外线灯下观察斑点的荧光。
【注意事项】
1.每次检查应采用已知PK正常的标本作为正常对照，利于结果观察判断。
2.白细胞和血小板中含有与红细胞中类型不同的PK同工酶，实验尽量除去白细胞和血小板。另外，用冷冻复融和低渗反应液来使红细胞破坏，提高试验的可靠性。
3.NADH配制后不稳定，用前应以340nm的光吸收进行校正，以上配制好的NADH液经1:1000稀释后吸光度约为0.093。
【参考值】健康人的荧光斑点在25min内消失，第一点可见荧光，第二点荧光消失。
【临床意义】荧光斑点不消失或25min后才消失，说明丙酮酸激酶缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光25～60min消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光60min不消失。
（五）丙酮酸激酶活性检测
【原理】丙酮酸激酶（PK）活性检测与荧光斑点法的原理相同。通过检测NADH转变为NAD，反映丙酮酸激酶的活性。NADH在340nm波长下有一特定吸收峰，而NAD没有吸收峰，在此波长下，检测NADH减少的速率，推算PK活性。
【参考值】13.01～6.99U/g Hb。
【临床意义】
1.先天性丙酮酸激酶缺乏，PK活性降低或消失，纯合子患者PK值在正常活性的25%以下，杂合子患者为正常的25%～50%。
2.继发性丙酮酸激酶缺陷 如白血病、再生障碍性贫血、MDS等，PK活性也可减低。
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